一株赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株及其应用

本发明属于生物工程领域，具体涉及一株赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株及其应用。

背景技术：

1、目前，提高微生物有机溶剂耐受性的方法包括优化微生物中一些蛋白质的表达水平以及对其中一些蛋白质进行分子改造。例如mingardon等人证实增加外排泵acrab-tolc的表达能够增加大肠杆菌escherichia coli对正己烷的耐受性(zhang y.,dong r.,zhangm.,gao native efflux pumps of escherichia coli responsible for short andmedium chain alcohol.biochem.eng.j.,2018,133,149-156)；nishida等人的结果表明两种abc转运体(pdr10p和snq2p)的过表达导致酿酒酵母saccharomyces cerevisiae产生对正十烷和正十一烷的耐受性，然而snq2p和yor1p转运体的过表达与酿酒酵母saccharomyces cerevisiae对dmso耐受性相关(nishida n.,ozato n.,matsui k.,kurodak.,ueda m.abc transporters and cell wall proteins involved in organic solventtolerance in saccharomyces cerevisiae.j.biotechnol.,2013,165(2),145-152)。foo等人采用定向进化策略对转运体acrb进行分子改造，他们分离得到两株对正辛烷和α-蒎烯的耐受性提高的突变体，其中的氨基酸突变位点n189h、t678s、q737l和m844l与正辛烷和α-蒎烯的外排效率相关(foo j.,leong s.directed evolution of an e.coli innermembrane transporter for improved efflux of biofuelmolecules.biotechnol.biofuels,2013,6(1),81)。

2、有机溶剂是具有不同化学结构的多种物质，它们在人类社会中扮演着不同的角色。例如乙醇、丁醇、丙酮等大宗化学品可以通过微生物发酵法生产,但是这些较高浓度的代谢产物会对生产菌株的生长和代谢产生较强的抑制作用,大大影响了生产效率。此外，全细胞常常被应用于生物催化过程中。然而,在生物催化过程中，有机溶剂对催化细胞的毒性成为限制全细胞催化的主要瓶颈。在生物法处理环境中污染物时,微生物也不可避免地接触到各种有机溶剂。因此，如何维持微生物在这些环境中的生物活性也是提高生物修复效率的关键性技术问题。因此提高微生物的有机溶剂耐受性,对于生物法生产一些大宗化学品、全细胞生物催化和一些环境污染物的生物修复都具有重要意义。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株，所述增强株具有更好的甲苯和苯酚耐受性，可用于降解甲苯和苯酚等污染物，对甲苯和苯酚污染的水或土壤或底泥进行修复；由于所述增强株具有更强的甲苯和苯酚耐受性，因此其在高含甲苯和苯酚的环境中依然能有效和充分发挥其生物降解活性，并能保持更长时间的生物活性。

3、(二)技术方案

4、第一方面，本发明提供了一种赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株，其是在r.ruber sd3野生株中提高来自赤红球菌r.ruber sd3的甲苯胁迫响应蛋白基因tsrp1的表达所得到的重组菌株。

5、第二方面，本发明提供了一种赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株的构建方法，其包括：pcr扩增赤红球菌r.ruber sd3的甲苯胁迫响应蛋白基因tsrp1，构建携带tsrp1基因的质粒；将所述质粒导至大肠杆菌jm109中，大量培养重组大肠杆菌并提取所述质粒，将提取的质粒转入赤红球菌r.ruber sd3感受态细胞中，得到赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株r.ruber tsrp1e。

6、根据本发明的较佳实施例，所述的构建方法包括以下步骤：

7、(1)挑取赤红球菌r.ruber sd3单菌落，培养后得到种子液，随后扩大培养得到扩大培养液，提取赤红球菌r.ruber sd3基因组dna，以r.ruber sd3基因组dna为模板，进行pcr扩增tsrp1基因并对pcr产物进行纯化；

8、(2)将赤红球菌r.ruber sd3的甲苯胁迫响应蛋白基因tsrp1的pcr扩增产物与pnv18质粒分别进行双酶切，酶切位点为bamhⅰ、hindⅲ；酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带用切胶器切下，使用胶回收试剂盒对酶切后的目的基因与载体进行回收；

9、(3)将酶切的目的基因与载体进行酶连构建穿梭表达质粒pnv18-tsrp1；

10、(4)将穿梭表达质粒pnv18-tsrp1转化至大肠杆菌e.coli jm109感受态细胞中，大量培养重组菌并提取质粒pnv18-tsrp；

11、(5)制备赤红球菌r.ruber sd3感受态细胞，并将质粒pnv18-tsrp1电转至赤红球菌r.ruber sd3感受态细胞中，得到赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株r.ruber tsrp1e。

12、步骤(2)中，甲苯胁迫响应蛋白基因tsrp1的pcr产物的制备方法为：先合成tsrp1基因pcr扩增引物：正向引物的序列为5'-cgcggatccatgac caccgccaagaccc-3'；反向引物的序列为5'-ccggaattccttgaggagatcgcgggcg-3'，横线处分别为bamhⅰ和ecorⅰ的酶切位点；

13、再以r.ruber sd3基因组dna为模板，扩增tsrp1片段；利用纯化试剂盒对pcr产物进行纯化。

14、步骤(3)是在16℃过夜酶连。

15、步骤(5)中，制备赤红球菌r.ruber sd3感受态细胞的方法为：

16、在固体lb培养基划线活化后的野生型r.ruber sd3单菌落挑至50ml lb液体培养基中，于35℃、180rpm恒温摇床中培养60h；扩大培养液按照1:100的比例转接，于35℃、180rpm恒温摇床中震荡培养至od600nm值为0.6，冰浴15min；在4℃、12000rpm离心2min，弃去上清液；加入5倍体积相应预冷好的电转缓冲液，轻柔悬浮菌体沉淀，离心2min，重复洗涤至少三次，洗涤完成后加电转缓冲液轻柔悬浮得到r.ruber sd3感受态细胞。

17、步骤(5)中，将质粒pnv18-tsrp1电转至赤红球菌r.ruber sd3感受态细胞的方法为：将r.ruber sd3感受态细胞和质粒pnv18-tsrp1在电转杯中混合，在电场强度为14kv/cm时，电击5.6ms；随后，迅速加入相应无抗生素的复苏培养基，35℃、150rpm培养4h，涂布在含卡那霉素平板上，35℃倒置培养60h，挑取单菌落振荡培养24h，进行pcr鉴定，获得赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株。

18、第三方面，本发明提供了一种赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株，命名为rhodococcus ruber tsrp1e，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m2023244，保藏日期2023年3月6日，保藏地址：武汉大学中国典型培养物保藏中心。

19、第四方面，本发明还包括赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株的应用，其包括：降解甲苯和苯酚等污染物；或对甲苯和苯酚污染的水或土壤或底泥进行修复。

20、(三)有益效果

21、与r.ruber sd3野生株相比，赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株受到苯酚和甲苯胁迫后，tsrp1基因的mrna相对表达量分别提高到野生株的7.97倍和1.49倍。赤红球菌环二鸟苷酸效应蛋白增强株对甲苯和苯酚耐受性显著高于r.ruber sd3野生株，具有更优的环境适应能力。

22、赤红球菌(rhodococcus ruber)是一种革兰氏阳性菌，它具有广泛的底物作用谱和多种分解代谢活性。因此，本发明所获得的增强株能在高含甲苯和苯酚的环境中充分发挥其生物降解活性，可用于降解甲苯和苯酚等污染物；或对甲苯和苯酚污染的水、土壤或底泥进行修复。