一种番茄HD-ZIP类转录因子和蛋白编码序列及应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种番茄hd-zip类转录因子基因和蛋白编码序列及应用。

背景技术：

1、番茄(solanum lycopersicum)是茄科(solanaceae)番茄属(solanum)一年生或多年生草本植物，是果实类蔬菜的代表，是目前世界上栽培最广泛的蔬菜之一。番茄果实色彩鲜艳、肉厚汁多、风味独特，且富含多种维生素、有机酸、氨基酸、矿物质和类黄酮等，不仅营养价值高，还具有抗氧化、助消化、降血脂和抑癌等诸多益处，故深受消费者喜爱。番茄品种多样，栽培面积大，产量高，但在贮藏过程中存在易失水腐烂、货架期短的难题。全球每年番茄净产值超过500亿美元，但因番茄的货架期很短，每年超过总产量的25％都因失水腐烂变质，经济损失巨大。因此，如何延长番茄果实货架期一直是全球农业和食品领域的重要研究方向。

2、先前研究表明，番茄果实货架期短主要是由于番茄果实容易失水软化，其中果实采后失水是影响番茄货架期的主要因素。目前，国内外延长番茄果实货架期的方法大致可分为物理方法、化学方法和生物学方法。物理方法指借助特定的设备，控制储藏环境的温度或气体，以降低果实的呼吸和代谢速率而延缓果实过熟、失水及软化。化学方法指对果实喷施或涂抹化学药物，以延缓果实过熟、失水及软化或杀灭果实表面的微生物而减少果实的腐烂。而生物学方法主要指利用生物技术方法修饰番茄乙烯产生或信号途径相关的基因，修饰果实角质层相关基因或者果实细胞壁及软化相关的基因，进而延缓果实过度成熟和失水软化过程。

3、物理方法和化学方法都能有效延长番茄果实的货架期，但是物理方法大多依赖设备成本较高，化学方法或多或少有化学残留，易影响番茄的风味和易发生食品安全问题。此外，为解决货架期短的问题，技术人员往往还会采用塑料袋贮藏法、化学药品贮藏法以及气调贮藏法来延长番茄果实的储藏时间；而对于需要远距离运输的番茄果实，常常会在绿熟期就开始采摘，以尽量延长其货架期，但是这会导致番茄在食用时风味和营养成分与自然成熟的果实有较大的差别。而且，这些方法不仅增加了成本，而且还严重影响了番茄果实的风味及营养价值。

4、因此，利用生物学方法一旦育成品种，无需借助特殊的设备或使用化学药物即可延长番茄果实货架期，成本低廉且安全性好，是公认的延长番茄果实货架期最理想的方法。但是，生物学方法的难点和关键在于研究并找到调控番茄果实失水软化的合适的基因，且利用生物技术修饰这些基因后既要能延长果实货架期，又不影响果实的营养成分、活性成分和风味等。目前基因工程的目标操控基因主要包括乙烯合成、乙烯信号传导和细胞壁果胶酶活性相关基因。乙烯的大量合成能够促进果实成熟，因此减少乙烯合成确实能够延长果实贮藏时间，但乙烯的缺少同时也影响果实的营养成分、活性成分和风味等。上述相关基因往往在果实发育和品质形成中也有重要作用，因而以上生物学方法虽能有效延缓果实的成熟和失水软化但往往不可避免的导致番茄果实品质下降，并不适合生产应用。此外，目前通过生物学方法延长番茄果实采后货架期的方法大多数通过转基因实现，而转基因番茄的监管严格，公众对转基因食品的安全性存有疑虑，转基因番茄的安全性需要较长时间的评价测试，以及需要较长的时间来获得市场及公众的认可。而基因编辑技术，可以做到不增加任何外源dna成分的前体下，改变目标基因的功能，其安全性比转基因技术高，监管条例也比转基因更为宽松，公众对基因编辑产品的接受度也高于转基因产品。

5、因此，从全新的角度，筛选鉴定可参与调控采后番茄保鲜的新基因，并结合基因编辑技术方法，培育出既能延长番茄果实货架期，又不影响果实成熟、营养成分、活性成分和风味的番茄新品种具有更好地市场应用前景。

6、因此，本领域的技术人员致力于开发一种通过基因编辑技术，筛选鉴定可参与调控采后番茄保鲜的新基因，并结合基因编辑技术方法，培育出既能延长番茄果实货架期，又不影响果实成熟、营养成分、活性成分和风味的番茄新品种。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是通过基因编辑技术，筛选鉴定可参与调控采后番茄保鲜的新基因，并结合基因编辑技术方法，培育出既能延长番茄果实货架期，又不影响果实成熟、营养成分、活性成分和风味的番茄新品种，

2、以解决目前番茄果实采后货架期短的问题。

3、为实现上述目的，本发明提供了一种番茄hd-zip类转录因子基因，即番茄slhdziv14基因，其基因编码区核苷酸序列如序列表seq id no:2所示。

4、进一步地，slhdziv14基因组核苷酸序列如序列表seq id no:1所示。

5、进一步地，slhdziv14基因编码区的氨基酸序列如序列表seq id no:3所示。

6、本发明还提供了一种番茄hd-zip类转录因子基因在调控番茄果实采后失水率的应用。

7、进一步地，上述应用包括以下步骤：

8、步骤1、利用植物crispr/cas9基因编辑系统，构建靶向slhdziv14基因的基因编辑载体，基因编辑载体包含slhdziv14基因位点；

9、步骤2、将步骤1构建的靶向slhdziv14基因的基因编辑载体导入农杆菌感受态细胞中，获得相应的农杆菌工程菌；

10、步骤3、将步骤2获得的农杆菌工程菌通过叶盘法转化番茄植株,得到含有番茄slhdziv14基因编辑载体的组培再生番茄植株；

11、步骤4、从步骤3得到的再生番茄植株中提取dna，通过鉴定，得到敲除番茄slhdziv14基因编辑后的纯合编辑植株。

12、进一步地，步骤1中基因编辑载体为pagm4723-cr-slhdziv14。

13、进一步地，步骤4中鉴定的步骤为：先鉴定是否为转基因阳性植株；对于转基因阳性植株，通过靶位点上下游附近设计的扩增引物扩增转基因阳性植株中包含靶序列的pcr片段，pcr片段经sanger测序鉴定是否为基因编辑；得到敲除番茄slhdziv14基因编辑后的纯合编辑植株。

14、进一步地，鉴定是否为转基因阳性植株的检测引物序列为：cas9f5’-cctgtttggtaatcttatcgc-3’和cas9r 5’-gtctttccactctgcttgtctcg-3’。

15、进一步地，靶序列的pcr片段引物序列为：cr-ziv14-indel-f5’-ttttcaaatcttgcgtgtaggc-3’和cr-ziv14-indel-r5’-tgggcttatcagcatctattgg-3’。

16、本发明还提供了一种的番茄hd-zip类转录因子基因在调控番茄货架期的应用。

17、进一步地，在番茄中编辑敲除番茄hd-zip类转录因子基因，即番茄slhdziv14基因。

18、进一步地，将番茄slhdziv14基因在番茄植株中进行基因编辑敲除。

19、进一步地，通过调控番茄果实毛的密度进而调控番茄果实采后失水的速率。

20、进一步地，筛选并鉴定获得参与果实毛起始发育的slhdziv14基因，通过基因编辑敲除该基因后，番茄果实毛显著减少，番茄果实采后失水速率显著降低，货架期延长。

21、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明通过番茄果实毛的密度影响果实采后失水及速率；

22、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明构建slhdziv14基因编辑载体的过程；

23、在本发明的较佳实施方式3中，详细说明番茄slhdziv14基因的克隆和过表达载体的构建；

24、在本发明的较佳实施方式4中，详细说明番茄slhdziv14基因编辑载体和过表达载体的遗传转化和鉴定过程；

25、在本发明的较佳实施方式5中，详细说明番茄slhdziv14基因编辑植株和slhdziv14基因过表达植株表型分析过程；

26、在本发明的较佳实施方式6中，详细说明番茄slhdziv14基因编辑植株和slhdziv14基因表达植株果实采后失水实验过程。

27、本发明有益的技术效果如下：

28、在没有外界干扰的情况下，番茄果实表面长有许多果实毛，但是在采摘，运输，清洗，包装等操作时，番茄果实毛极易被破坏脱落，脱落后果实毛根部便在番茄果实表面留下一个孔洞。因番茄果实没有气孔且覆盖较厚的疏水角质层，该孔洞便成为番茄果实采后水分散失的通道。番茄果实毛是长期被忽视的结构，本发明创造性的从果实毛密度的角度提出调控果实采后失水率从而调控货架期的方法。

29、本发明提供的番茄slhdziv14基因可以作为基因编辑修饰的目标基因，通过基因编辑可以改变该基因在番茄果实毛形成过程中的作用，降低番茄果实毛的密度，进而使得番茄果实采后失水速率降低，显著延长了番茄采后的货架期。果实毛的减少有效的避免了番茄因果实毛脱落留下孔洞而引发的采后失水问题。有效解决了番茄果实在采摘，运输，清洗，包装，储存，销售等多个环节的失水问题，延长了番茄果实货架期。

30、slhdziv14基因在番茄果实毛中优势表达，通过crispr/cas9基因编辑技术敲除该基因后发现，该基因参与番茄果实毛的形成，敲除该基因后番茄果实表面果实毛显著减少。通过采后果实失水实验发现，与wt野生型果实相比，slhdziv14基因编辑的株系更不容易失水。室温放置6天后，slhdziv14基因编辑番茄果实的失水率和wt番茄果实失水率出现明显差异；当室温放置10天后，wt番茄果实表面因失水皱缩明显高于基因编辑番茄果实；当室温放置20天后，野生型番茄果实失水率高达20％左右，而slhdziv14基因编辑番茄的失水率仅为10％左右，因此，本发明提供的番茄slhdziv14基因可以作为基因编辑修饰的目标基因，通过基因编辑可以改变该基因在番茄果实毛形成过程中的作用，降低番茄果实毛的密度，进而使得番茄果实采后失水速率降低，显著延长了番茄采后的货架期，该应用方法安全、可靠，保鲜思路独特，在番茄采后保鲜选育新品种研究等方面具有很好的应用前景。

31、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。