一种用于枯草芽孢杆菌基因编辑系统的构建方法及其应用与流程

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌的基因编辑系统的构建方法及应用。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种常见的革兰氏阳性细菌，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，具有生长速度快，营养要求低等特性。枯草芽孢杆菌能高效分泌许多蛋白及代谢产物，可以自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类。枯草芽孢杆菌能够分泌多种具有潜在生物医药和工业利用价值的低分子量抗菌肽和生物表面活性物质，如表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、丰原素(fengycin)、细菌素(tasa)等，是最具潜力和应用价值的芽孢杆菌之一。枯草芽孢杆菌产生的脂肽类活性物质具有强大的抗菌作用，同时它们又不会破坏动物体内的正常细胞，对人体组织来说绿色安全，而且具有“传统抗生素”无法比拟的优越性，是一种真正的广谱抗菌剂。同时还具有良好的乳化性能和发泡性能，在石油化工、环境治理、生物医药、食品加工、动物养殖和农业生防等领域具有良好的应用前景，已成为研究开发的热点。野生菌株的产量较低，难以满足工业化生产需求。开发新型基因编辑技术进行野生枯草芽孢杆菌的代谢工程改造已成为当前的研究热点。目前枯草芽孢杆菌的基因编辑方法主要包括crispr/cas9及衍生系统相关的基因编辑工具及利用简单同源重组进行的基因编辑技术2大类。其中，基于crispr/cas9系统的基因编辑技术具备编辑效率高(90％以上)且操作简便的优势，但crispr/cas9系统由于grna造成的脱靶效应仍难以消除，易造成非目标靶基因的编辑；该系统由于要引入cas9及grna等多个元件质粒构建较为复杂。基于简单同源重组进行的基因编辑技术一般是将含有筛选标记的自杀质粒或者dna片段导入菌株，利用菌株自身的同源重组进行单交换或双交换，并通过筛选标记进行突变子筛选。该方法操作简便载体元件较少也不存在脱靶效应，但一般效率较低且容易在基因组上留下筛选标记，不利于菌株进行连续编辑。

2、而一种既无脱靶风险，还简单、高效(＞95％)且无痕的枯草芽孢杆菌基因编辑技术，目前尚未有报道。目前针对枯草芽孢杆菌的基因编辑技术仍是存在脱靶风险但高效的crispr/cas9系统，及传统的自杀载体及线性片段介导的低效同源重组技术。本发明开发新型穿梭质粒介导的高效编辑技术，能为后续代谢工程等研究打下基础。

技术实现思路

1、本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种适用于枯草芽孢杆菌的穿梭质粒及介导的基因编辑应用，通过基因敲除/入质粒及消除质粒这一对穿梭质粒实现靶基因简单、高效(＞95％)且无痕的敲除(入)。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该用于枯草芽孢杆菌基因编辑系统的构建方法，其特征在于：包括有如下步骤：

3、①构建包括由含有kan-upp正负筛选标记的基因敲除/入质粒；所述步骤①的基因敲除质粒是在芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pht01的基础上，插入kan-upp基因敲除盒及红色荧光表达盒；

4、所述kan-upp基因敲除盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心元件：kan-upp上游同源臂、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶筛选基因(upp)表达盒、卡那霉素抗性基因(kan)表达盒、kan-upp下游同源臂；

5、所述步骤①的基因敲入质粒是在芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pht01的基础上，插入基因敲入盒及荧光表达盒；

6、所述基因敲入盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶筛选基因(upp)表达盒、卡那霉素抗性基因(kan)表达盒、插入基因、靶基因下游同源臂；

7、②利用步骤①的基因敲除/入质粒介导的基因编辑和质粒消除，基因敲除/入质粒转入芽孢杆菌后，通过多轮传代提高质粒的基因敲除/入盒的同源臂序列与靶基因上下游同源序列的同源交换概率，实现同源臂中包含正负筛选标记的敲除(入)序列与靶基因序列的交换；

8、③在步骤②的多轮传代的基础上再进行一轮无抗生素传代，从而将编辑质粒从芽孢菌株中去除；

9、④将步骤③的多轮传代及无抗传代后的菌液涂布于正负筛选平板，同时采用荧光镜照射平板挑选无红色荧光(即质粒消除成功)的单克隆，从而获得含有正负筛选标记的基因敲除/入菌株；

10、⑤构建消除质粒，该步骤的消除质粒是在芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pht01的基础上，插入荧光表达盒及同源臂，将消除质粒转入步骤④中含有正负筛选标记的基因敲除/入菌株，通过多轮传代将消除质粒中的同源臂与基因组中kan-upp正负筛选标记的上下游序列进行同源重组，从而敲除基因组中的正负筛选标记，实现基因的无痕编辑；

11、⑥将多轮传代及无抗传代后的菌液涂布于正负筛选平板，同时采用荧光镜照射平板挑选无红色荧光(即质粒消除成功)的单克隆，从而获得无痕的基因敲除/入菌株。

12、进一步地，所述基因敲除/入质粒及其介导的基因编辑和质粒消除的具体步骤如下：

13、①把构建好的基因敲除/入质粒通过spizizen转化方法转入枯草芽孢杆菌细胞中，提质粒酶切验证；

14、②转化成功的含敲除(入)质粒转化子，转接1％的菌液至编辑培养基，30℃、200rpm摇菌至稳定期前期，传代3次；

15、③转接1％的步骤②中所得菌液至质粒消除培养基，30℃、200rpm培养至稳定期中期；

16、④最后取100ul步骤③中的培养基均匀涂布于含有卡那霉素的正筛选培养基平板上，30℃过夜培养；

17、⑤将步骤④中正筛选平板上的单克隆进行荧光镜观察，不发红色荧光菌落挑出，进行菌液pcr，测序验证，获得含有正负筛选标记的基因敲除/入菌株。

18、进一步地，所述消除质粒及其介导的标记消除和质粒消除的具体步骤如下：

19、①把构建好的消除质粒通过spizizen转化方法转入含有正负筛选标记的基因敲除/入菌株中，提质粒酶切验证；

20、②转化成功的含消除质粒转化子，转接1％的菌液至编辑培养基，30℃、200rpm摇菌至稳定期前期，传代3次；

21、③转接1％的步骤②中所得菌液至质粒消除培养基，30℃、200rpm培养至稳定期中期；

22、④最后取100μl步骤③中的培养基均匀涂布于含有5-氟尿嘧啶的负筛选培养基平板上，30℃过夜培养；

23、⑤将步骤④中正筛选平板上的单克隆进行荧光镜观察，不发红色荧光菌落挑出，进行菌液pcr，测序验证，获得无痕的基因敲除/入菌株。

24、本发明还提供一种利用上述枯草芽孢杆菌的基因系统的构建方法在枯草芽孢杆菌菌株改造中的应用，其特征在于：基因敲除的基因为sfp基因；

25、基因敲除质粒依次含有氨苄抗性基因表达盒、复制子、红色荧光蛋白表达盒、氯霉素抗性基因、靶标基因上游序列、kan-upp表达盒、靶标基因下游序列；

26、基因敲入质粒(在sfp基因终止密码子处敲入sfp′基因)依次含有氨苄抗性基因表达盒、复制子、红色荧光蛋白表达盒、氯霉素抗性基因、靶标基因上游序列、sfp′基因序列、kan-upp表达盒、靶标基因下游序列；

27、所述氨苄抗性基因表达盒如seq id no：1所示；

28、复制子如seq id no：2所示；

29、红色荧光蛋白表达盒如seq id no：3所示；

30、氯霉素抗性基因如seq id no：4所示；

31、靶标基因(敲除sfp)上游序列如seq id no：5所示；

32、kan-upp表达盒如seq id no：6所示；

33、靶标基因(敲除sfp)下游序列如seq id no：7所示；

34、所述基因敲除质粒pht01-1-sfp(敲除sfp)的核苷酸序列如seq id no：8所示；

35、靶标基因(敲入sfp′)上游序列如seq id no：9所示；

36、靶标基因(敲入sfp′)下游序列如seq id no：10所示；

37、sfp′基因的核苷酸序列如seq id no：11所示；

38、所述基因敲入质粒pht01-1+sfp′(敲入sfp′)的核苷酸序列如seq id no：12所示；

39、所述敲除(入)质粒转入芽孢杆菌bs168△upp后，通过反复传代提高同源重组概率，从而提高编辑效率，重复次数根据具体基因编辑难度进行三次及以上的传代；传代后再在无抗性液体培养基中传代一次，然后涂布在含有卡那霉素的正筛选培养基平板上，在挑选无红色荧光的单克隆，pcr及测序验证，获得含有正负标记kan-upp的基因敲除/入菌株。

40、进一步地，当基因敲除的基因为sfp基因，该消除质粒依次含有氨苄抗性基因表达盒、复制子、红色荧光蛋白表达盒、氯霉素抗性基因、敲除(入)基因上游序列、敲除(入)基因下游序列；

41、所述消除质粒中敲除基因(敲除sfp)上游序列的核苷酸序列如seq id no:15所示；

42、所述消除质粒中敲除基因(敲除sfp)下游序列的核苷酸序列如seq id no:16所示；

43、所述消除质粒中敲入基因(敲入sfp′)上游序列的核苷酸序列如seq id no:17所示；

44、所述消除质粒中敲入基因(敲入sfp′)下游序列的核苷酸序列如seq id no:18所示；

45、所述消除质粒pht01-1-sfp-0(敲除sfp)的核苷酸序列如seq id no:13所示；

46、所述消除质粒pht01-1+sfp′-0(敲入sfp′)的核苷酸序列如seq id no:14所示。

47、与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明构建了一种相较于crispr无脱靶风险并且编辑效率高的无痕编辑方法，其编辑效率可达100％其中构建的含有kan-upp正负筛选标记的基因敲除/入质粒和消除质粒构成的穿梭载体，并通过荧光镜照射进行可视化消除，既可以传代，质粒消除也方便，另外多轮传代有效叠加了编辑效率，应用该编辑方法能实现多个基因的无痕敲除/插入、能实现连续编辑且编辑效率超95％，本发明提供的基因编辑工具对于实现枯草芽孢杆菌代谢工程改造具有重要的应用价值。