一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用的制作方法

本技术涉及变异或遗传工程领域，尤其涉及一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用。

背景技术：

1、甲基转移酶（egtd）是麦角硫因合成的关键酶。2010年，seebeck. f p将来源于耻垢分枝杆菌（ mycobacterium smegmatis）的egtabcde等酶的基因在大肠杆菌中重组表达，实现了大肠杆菌体内合成麦角硫因(florian p.seebeck，jacs,2010,132,6632-6633)。egtd酶负责将s-腺苷甲硫氨酸的甲基转移至组氨酸，生成组氨酸甜菜碱，是麦角硫因合成的第一步。2015年，vit等对egtd进行表征，该酶对底物组氨酸的转化数只有0.58 s-1(misson, laetitia, chembiochem: a european journal of chemical biology,2015.)，是代谢通路中活性最高的egte酶活性的2.3%。因此，egtd是麦角硫因合成的关键限速步骤。2015年，vit等将来源于耻垢分枝杆菌的麦角硫因合成的关键酶egtd进行结构解析（pdb 4pin）(misson, laetitia, chembiochem: a european journal of chemicalbiology, 2015.)，获得egtd及其底物的结构复合物，对egtd酶活性中心进行改造，突变体e285a，e252a/e285a，但这些突变体均未提高组氨酸甲基转移酶活性。

2、目前为止，还没有通过改变氨基酸提高egtd酶活的案例。因此，亟需一种高酶活的egtd，以解决甲基转移酶酶活较低，不符合工业化生产要求的问题。

技术实现思路

1、麦角硫因的合成反应的第一步为组氨酸在甲基转移酶的催化下合成组氨酸甜菜碱，该步骤是麦角硫因合成步骤中的重要限速步骤。由于目前文献和专利中报道的甲基转移酶酶活较低，均不符合工业化生产的要求。

2、因此，本发明通过对甲基转移酶进行定点突变并进行体外酶活测定，经筛选后首次获得了一种酶活提高的甲基转移酶突变位点及酶突变体，有效提高了甲基转移酶酶活和麦角硫因产量，为麦角硫因工业化生产提供一种新的甲基转移酶突变体及工程菌。

3、一方面，本技术提供了一种甲基转移酶突变体，所述甲基转移酶突变体包括下述a1）-a3)中任一种：

4、a1) 包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变的蛋白质：第58位、第203位，其中各氨基酸位置编号由参比序列定义，所述参比序列如seq id no.1所示；

5、a2）为由a1）所述蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1）所述蛋白质具有90％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

6、a3）为在a1）或a2）的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

7、优选的，a2）的蛋白质与a1）中限定的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上序列同一性。

8、本领域技术人员可以理解的是，本技术中蛋白质编码规则遵循常用规则，以第58位为例，所述第58位突变即指自参比序列n端开始向c端方向顺序计数第58个氨基酸位点。

9、进一步的，所述第58位脯氨酸残基突变为亮氨酸残基；和/或，所述第203位缬氨酸残基突变为天冬酰胺残基。

10、进一步的，所述甲基转移酶突变体包括如seq id no.3所示氨基酸序列和/或如seq id no.5所示氨基酸序列。

11、另一方面，本技术还提供了生物材料，所述生物材料包括下述b1）-b6）中任一种：

12、b1）核酸分子，所述核酸分子编码上述甲基转移酶突变体；

13、b2）表达盒，所述表达盒含有b1）所述核酸分子；

14、b3）重组载体，所述重组载体含有b1）所述核酸分子和/或b2）所述表达盒；

15、b4）重组微生物，所述重组微生物含有b1）所述核酸分子、b2）所述表达盒、和/或b3）所述重组载体；

16、b5）重组细胞，所述重组细胞含有b1）所述核酸分子、b2）所述表达盒、和/或b3）所述重组载体；

17、b6）全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有b1）所述核酸分子、b2）所述表达盒、b3）所述重组载体、b4）所述重组微生物、和/或b5）所述重组细胞。

18、本文所述表达盒中还可包含启动子、终止子、标记基因等功能性元件，本领域技术人员可根据实际情况进行常规选择，只要能够完成b1）所述核酸分子的表达即可，此处不再对表达盒的结构及组成进行过多限制。

19、本文所述载体是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）或病毒载体。具体可为载体pet30a和/或pacyc-psc101-ptac质粒。

20、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（ escherichia sp.）、欧文氏菌属（ erwinia sp.）、土壤杆菌属（ agrobacterium sp.）、黄杆菌属（ flavobacterium sp.）、产碱菌属（ alcaligenes sp.）、假单胞菌属（ pseudomonas  sp.）、芽胞杆菌属（ bacillus sp.）、短杆菌属（ brevibacterium sp.）、棒状杆菌属（ corynebacterium sp.）、气杆菌属（ aerobacter sp.）、肠杆菌属（ enterobacteria sp.）、微球菌属（ micrococcus sp.）、沙雷氏菌属（ serratia sp.）、沙门氏菌属（ salmonella  sp.）、链霉菌属（ streptomyces sp.）、普罗维登斯菌属（ providencia sp.）等但不限于此。

21、本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞，所述细胞可为任何可以合成目的麦角硫因的生物细胞。

22、可以理解的是，本领域技术人员可以根据实际情况选择适合的基因编辑系统和基因编辑方法完成所述突变改造。

23、进一步的，b1）所述的核酸分子包括下述c1）-c5）中任一种：

24、c1）编码上述甲基转移酶突变体的核酸分子；

25、c2）编码seq id no.3或seq id no.5氨基酸序列的核酸分子；

26、c3）核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.6所示的核酸分子；

27、c4）与c1）-c3)中任一所述核酸分子具有98%或98%以上同一性，且编码上述甲基转移酶突变体的核酸分子；

28、c5）在严格条件下与c1）-c3)中任一所述核酸分子杂交，且编码上述甲基转移酶突变体的基因组dna分子。

29、优选的，c4)的核酸分子与c1）-c3)中任一所述核酸分子具有至少98％、99％、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%以上的同一性。

30、进一步的，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母中的一种或多种。

31、在一种优选的实施方式中，所述重组微生物（宿主）为egt33和bl21（de3）。

32、另一方面，本技术还提供了如上述的甲基转移酶突变体或如上述的生物材料在提高甲基转移酶酶活性中的应用。

33、本技术中首次获得了两个egtd酶活提高的关键氨基酸位点，分别为耻垢分枝杆菌来源的egtd酶的第58位活性位点和第203位活性位点，具体为将其58位活性位点由脯氨酸突变成亮氨酸，及第203位活性位点由缬氨酸残基突变为天冬酰胺残基，以上两处关键氨基酸位点经过突变后均能够有效提高egtd酶活性，相比未突变的egtd酶，突变后egtd酶活性分别提高了39％和17％，为该酶的后续酶活进一步提升提供了关键靶点。

34、另一方面，本技术还提供了如上述的甲基转移酶突变体或如上述的生物材料在下述d1）-d3）任一中的应用：

35、d1）构建用于生产麦角硫因的重组微生物；

36、d2）制备麦角硫因；

37、d3）调控重组微生物生产麦角硫因的产量。

38、本技术中以大肠杆菌表达系统为例，获得了包含上述突变的工程菌，并将工程菌应用于麦角硫因生产中。发现该突变能够有效提高麦角硫因产量，相比未突变的工程菌，突变后的工程菌能够将麦角硫因产量提高10％，麦角硫因最大产量可达228.28±11.53 mg/l。本技术所述突变有效提高了麦角硫因的合成效率，为麦角硫因的生产提供了一种新的合成途径和工程菌。

39、另一方面，本技术还提供了如上述的甲基转移酶突变体或如上述的生物材料在制备含麦角硫因的药品、食品或化妆品中的应用。

40、可选的，所述药品、食品或化妆品的剂型包括但不限于粉剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂，或例如化妆水、乳液、面霜、面膜等的外用涂擦剂，或例如洗发水、护发素、发膜等的日用品。

41、另一方面，本技术还提供了一种麦角硫因的生产方法，所述方法包括如下步骤：

42、步骤一、构建得到如上述的全细胞催化剂；

43、步骤二、培养所述全细胞催化剂，得到麦角硫因。

44、在一种优选的实施方式中，所述全细胞催化剂包括重组微生物。

45、麦角硫因的生产方法包括如下步骤：将所述重组微生物在37℃，200 rpm的条件下lb培养基过夜获得种子液，以接种量为10％转接至抗性发酵培养基，37 ℃、200 rpm的条件下培养0.5 h，加入终浓度为0.2 mm iptg，37 ℃条件下诱导培养10-12 h，生产麦角硫因。

46、本发明具有如下有益效果：

47、1、本发明采用高效的大肠杆菌表达系统，以目前报道的活性最高的耻垢分枝杆菌来源的egtd酶为初始菌株，利用酶的晶体结构分析，从活性中心位点中筛选出相关位点，共构建16株突变株，最后筛选获得了一种能够高效合成麦角硫因的工程菌；

48、2、本发明中首次获得egtd酶活提高的关键氨基酸位点，以耻垢分枝杆菌来源的egtd酶为初始序列，将其58位活性位点由脯氨酸突变成亮氨酸，能够有效提高egtd酶活性，相比未突变的egtd酶，突变后egtd酶能够使egtd酶活性提高39％，为该酶的后续酶活进一步提升提供了关键靶点；

49、3、本发明中获得的工程菌和高酶活性egtd酶能够用于麦角硫因生产过程中，相比未突变的工程菌，突变后的工程菌能够将麦角硫因产量提高10％，麦角硫因最大产量可达228.28±11.53 mg/l。