一种肺癌类器官的培养基体系及培养方法与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种肺癌类器官的培养基体系及培养方法。

背景技术：

1、在中国，肺癌是发病率和死亡率最高的肿瘤。尽管靶向治疗和免疫治疗相关的新药研发提高了肺癌的总体生存期。导致其预后不良的一个关键原因是新药研发成功率低。与血液系统恶性肿瘤新药研发的ⅲ期临床试验成功率可以超过50％相比，肺癌该成功率仅为30％。面对这一现状，寻找适于肺癌新药研究的临床前模型显得尤为重要。肺癌肿瘤类器官(patient-derived organoids,pdo)作为能够浓缩原始肿瘤的多组学特征、模拟患者肿瘤药敏特性的功能学模型在新药研发过程中脱颖而出。

2、为了了解肺癌，尤其是肿瘤的异质性，并将这一知识转化为临床应用，迫切需要有代表性和稳健的临床前肺癌模型。在之前的研究进展中，最普遍的临床前模型是小鼠模型和在二维培养中培养的患者来源的细胞系。然而，这两种模型存在许多缺陷，阻碍了其临床应用。癌症细胞系无法体现肿瘤的异质性,因此它们从根本上无法代表癌症的复杂性；而小鼠模型虽然可以保持遗传和原始肿瘤的组织学特点,但是小鼠模型成功率低，周期长；这使得在很大程度上几乎不可能对个性化治疗做出贡献。

3、肺癌类器官的体外培养可以表达肿瘤异质性，它保持了亲本肿瘤的关键特征，并有可能用于为个别患者选择抗癌药物，并可以快速构建的临床相关性高的肺癌模型，及肺癌类器官来满足研究需要。

4、然而，现有技术的培养基和培养方式难以在培养过程中保证肺癌类器官的活性，并且培养后的肺癌类器官衰老情况严重，导致应用效果差。另外，现有的培养技术还存在扩增慢、成本高等问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种肺癌类器官的培养基体系及培养方法。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本发明提供一种肺癌类器官的培养基体系，所述培养基体系包括初始培养基和减因子培养基；

4、所述初始培养基包括advanced dmem/f12基础培养基、glutamax添加剂、烟酰胺、smo受体激动剂sag、r-spondin-1重组蛋白、noggin蛋白、fgf-7、fgf-10、chir 99021因子、p38mapk抑制剂sb202190、rock抑制剂y-27632、b27、a83-01、cyclic pifithrin-α因子、foskolin以及硫酸酯酶2重组蛋白；

5、所述减因子培养基包括advanced dmem/f12基础培养基、glutamax添加剂、烟酰胺、smo受体激动剂sag、r-spondin-1重组蛋白、noggin蛋白、fgf-7、fgf-10、b27以及p38mapk抑制剂sb202190。

6、进一步，初始培养基和所述减因子培养基中均还包括ph缓冲液、抗菌剂和抗氧化剂；所述ph缓冲液为hepes，所述抗菌剂为primocin抗生素，所述氧化剂为n-乙酰半胱氨酸。

7、进一步，所述初始培养基中，glutamax添加剂的浓度为1×、hepes的-0浓度为10mm、烟酰胺的浓度为10mm、n-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mm、smo受体激动剂sag的浓度为0.5×、primocin抗生素的浓度为1×、r-spondin-1重组蛋白的浓度为250-500ng/ml、noggin蛋白的浓度为100-200ng/ml、fgf-7的浓度为25-100ng/ml、fgf-10的浓度为10-15ng/ml、chir 99021因子的浓度为150-250nm、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为0.5-1um、rock抑制剂y-27632的浓度为10-20μm、b27的浓度为1×、a83-01的浓度为0.5-1μm、cyclicpifithrin-α因子的浓度为2-6μm、foskolin的浓度为2-10um、硫酸酯酶2重组蛋白的浓度为200-500nm；溶剂为advanced dmem/f12基础培养基。

8、进一步，所述初始培养基中，r-spondin-1重组蛋白的浓度为500ng/ml、noggin蛋白的浓度为200ng/ml、fgf-7的浓度为100ng/ml、fgf-10的浓度为15ng/ml、chir 99021因子的浓度为250nm、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为1um、rock抑制剂y-27632的浓度为10μm、a83-01的浓度为0.5μm、cyclic pifithrin-α因子的浓度为6μm、foskolin的浓度为10um、硫酸酯酶2重组蛋白的浓度为500nm。

9、进一步，所述减因子培养基中，glutamax添加剂的浓度为1×、hepes的浓度为10mm、烟酰胺的浓度为10mm、n-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mm、smo受体激动剂sag的浓度为0.5×、primocin抗生素的浓度为1×、r-spondin-1重组蛋白的浓度为200-500ng/ml、noggin蛋白的浓度为100-200ng/ml、fgf-7的浓度为25-100ng/ml、fgf-10的浓度为10-15ng/ml、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为0.5-1um、b27的浓度为1×；溶剂为advanceddmem/f12基础培养基。

10、进一步，所述减因子培养基中，r-spondin-1重组蛋白的浓度为500ng/ml、noggin蛋白的浓度为200ng/ml、fgf-7的浓度为100ng/ml、fgf-10的浓度为15ng/ml、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为1um。

11、本发明还提供一种肺癌类器官的培养方法，采用如上述的培养基体系进行培养；其中，先在所述初始培养基中对病灶组织样本进行培养，再向培养液中添加所述减因子培养基继续培养。

12、进一步，包括以下步骤：

13、s1、获取待培养的肺组织样本并进行前处理，得到病灶组织样本；

14、s2、对所述病灶组织样本依次进行消化、重悬、过滤、离心后，收集细胞沉淀；

15、s3、将所述细胞沉淀重悬于基质胶中，再进行滴胶接种，接种完成后，静置直至胶滴全凝固；

16、s4、在每个所述胶滴上加入预热后的所述初始培养基；

17、s5、观察培养结果，当培养得到肺癌类器官微球时，在每个所述胶滴上添加所述减因子培养基，培养7～14天后，得到所述肺癌类器官。

18、进一步，所述步骤s5中，在每个所述胶滴上添加500μl预热至37℃的所述减因子培养基，再使用dpbs-ps进行封边处理。

19、进一步，所述步骤s3中，进行滴胶接种时，每个所述胶滴的体积为50μl，所述步骤s4中，每个所述胶滴上加入500μl预热至37℃的所述初始培养基，再并使用dpbs-ps进行封边处理。

20、本发明的有益效果为：

21、(1)本发明的肺癌类器官培养基体系，分为初始培养基和减因子培养基，初始培养基中含有的y27632、chir 99021、a8301、cyclic pifithrin-α、foskolin因子以及sulf2，这些因子对原代组织中分离的肺癌细胞生长尤为重要，可在免疫微环境构建时，促进免疫微环境形成；而在减因子培养基中将上述因子减去，防止高浓度细胞因子过度激活信号造成的衰老；

22、(2)本发明的肺癌类器官培养基体系，其中的减因子培养基可以避免持续多因子的刺激，降低这些因子对肺癌类器官的影响，提高细胞的异质性，有助于肺癌类器官保持原有特性，不易被驯化成细胞系或丧失异质性；

23、(3)本发明的肺癌类器官培养方法，可以显著提高肺癌类器官样本的培养成功率及增殖速度，同时显著提高肺癌类器官的活性；

24、(4)本发明的肺癌类器官培养方法，可减少外源因子的持续作用，较少人源操作误差；

25、(5)本发明的肺癌类器官培养基体系和培养方法，可极大降低肺癌类器官的建库成本；

26、(6)本发明的肺癌类器官培养基体系和培养方法，具有培养效率高、效果好、成本低的优点。