Cldn5基因在调控认知障碍中的功能及应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及cldn5基因在认知障碍诊断和治疗中的应用。

背景技术：

1、认知障碍(cognitive disorders，简称cds)，也称为神经认知障碍(neurocognitive disorders，简称ncds)，是一种主要影响认知能力(包括学习、记忆、感知和问题解决等)的心理健康障碍。一般被定义为：执行功能、学习和记忆、感知运动功能、语言、复杂注意力和社会认知等6种认知能力缺陷，通常代表为衰退，并可能有潜在的脑病理。后天形成的有阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈症、创伤性脑损伤(tbi)、帕金森症、朊病毒疾病和由于艾滋病毒感染所引起的神经认知障碍等；先天形成的则多见于发育迟缓（如自闭症谱系）。

2、诱导认知障碍的机制十分复杂，目前临床上尚不能够完全预防和治疗认知功能异常。内环境稳态是维护脑结构和功能的基本条件，而血脑屏障 (blood-brain barrier,bbb)则是维持该条件的重要结构基础。应激负荷人群和认知障碍患者均呈现一定程度的bbb泄漏；应激引起的bbb损伤可进一步影响氨基酸转运、免疫细胞迁移或炎性因子积聚，引发脑内环境稳态失衡，导致不同类型细胞及不同脑区间的交流与连接异常。然而，目前对于应激致认知损伤过程中下bbb功能发生异常的调控机制仍未完全阐明。找到并修复bbb损伤的关键节点分子是揭示应激性认知障碍致病机制和探索应激性认知障碍的临床治疗手段的关键所在。相邻内皮细胞之间彼此融合构成的闭锁结构即紧密连接 (tight junction,tj) 是bbb发挥正常生理功能的结构基础。之前的研究发现，cldn5等tj分子对于维持tj结构的完整性和bbb的低通透性至关重要，tj蛋白的表达失调或活性异常可导致bbb损伤。然而上述研究对tj蛋白-bbb-应激性认知障碍之间的内在机制缺少深刻的解释。

3、因此，针对认知障碍相关疾病的研究还需要进一步改进。

技术实现思路

1、本发明的第一方面，提供了一种认知障碍相关疾病的生物标志物，所述的生物标志物为紧密连接分子claudin-5（cldn5分子）。

2、优选的，所述的cldn5分子包括cldn5蛋白、cldn5基因。

3、优选的，所述的生物标记物的样本来源于血液、脑脊液或脑组织。

4、进一步优选的，所述的生物标志物的样本来源于脑组织中的前额叶皮层（prefrontal cortex，pfc）。

5、优选的，所述的认知障碍相关疾病包括但不限于应激性认知障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈症、创伤性脑损伤(tbi)、帕金森症、朊病毒疾病或由于艾滋病毒感染所引起的神经认知障碍。

6、本发明的第二方面，提供了一种上述第一方面所述的生物标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括：

7、1）检测cldn5蛋白表达水平的试剂；

8、2）检测cldn5基因表达水平的试剂。

9、根据具体实施方式的需要，所述的试剂可以是现有技术中任一试剂，只要能检测cldn5基因，例如cldn5的mrna表达水平和/或cldn5蛋白表达水平即可。

10、优选的，所述的检测cldn5基因表达水平的试剂包括引物和探针，和/或，所述的检测cldn5蛋白表达水平的试剂包括抗体或酶的底物。

11、优选的，所述的检测cldn5蛋白表达水平包括使用cldn5蛋白抗体（购买自thermofisher scientific，货号35-2500）、酶的底物，或者，使用elisa试剂盒（购买自华美生物，货号ceb-el005507mo）。

12、优选的，所述的检测cldn5基因的mrna的引物包括正向引物（seq id no：1）：5’-actctttgttaccttgaccgg-3’和/或反向引物（seq id no：2）：5’-cagctcgtacttctgtgacac-3’。

13、优选的，所述的检测cldn5基因的mrna的探针（seq id no：3）：5’-tgagtgctacccgtgccttaactg-3’。

14、本发明的第三方面，提供了一种上述第二方面所述的检测试剂在制备诊断认知障碍相关疾病的产品中的应用。

15、优选的，所述的产品包括但不限于诊断试剂盒、基因芯片、抗体，引物和（或）探针。

16、本发明的第四方面，提供了一种诊断产品，所述的诊断产品包括上述第二方面的检测试剂。

17、优选的，所述诊断产品包括诊断试剂盒、基因芯片、抗体，引物和（或）探针。

18、本发明的第五方面，提供了一种上述第一方面的生物标志物的调节试剂，所述的调节试剂提高cldn5蛋白表达水平，和/或，cldn5基因表达水平。

19、根据具体实施方式的需要，所述的调节试剂可以是现有技术中任一试剂，只要能调节cldn5基因的mrna表达水平和/或cldn5蛋白表达水平即可。

20、在本发明的一个具体实施方式中，所述的调节试剂包括：

21、1）cldn5蛋白；

22、2）包含cldn5基因的过表达载体；促进cldn5基因表达的调节因子。

23、进一步优选的，所述的促进cldn5基因表达调节因子包括但不限于增强子、启动子等等。

24、本发明的第六方面，提供了一种上述第五方面的调节试剂在制备治疗认知障碍相关疾病的产品中的应用。

25、根据具体实施方式的需要，所述的应用还包括治疗认知障碍相关疾病的并发症。

26、本发明的第七方面，提供了一种药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括上述第五方面的调节试剂。

27、本发明的第八方面，提供了一种阿尔兹海默症（ad）的治疗药物在制备治疗应激性认知障碍的产品中的应用。

28、优选的，所述治疗药物提高cldn5蛋白表达水平，和/或，cldn5基因表达水平。

29、更优选的，所述治疗药物包括多奈哌齐。

30、本发明的第九方面，提供了一种上述第一方面的生物标志物作为靶点在筛选诊断、治疗和/或预后评估认知障碍相关疾病的产品中的应用。

31、优选的，所述的筛选包括筛选cldn5蛋白表达水平和/或cldn5基因表达水平的检测试剂作为诊断和/或预后评估认知障碍相关疾病的产品，或者，所述的筛选包括筛选提高cldn5蛋白表达水平、和/或cldn5基因表达水平的调节试剂作为治疗认知障碍相关疾病的产品。

32、本发明的第十方面，提供了一种治疗认知障碍相关疾病的方法。

33、优选的，所述的方法包括向患病个体施用治疗有效量的上述第五方面的调节试剂，和/或，药物或药物组合物。

34、本发明的第十一方面，提供了一种cldn5基因表达的抑制剂，所述的抑制剂包括抑制cldn5表达的shrna，或者包含所述shrna的载体，所述shrna包含针对4、7和/或10设计的shrna。

35、优选的，所述的shrna包含针对seq id no：4设计的shrna。

36、进一步优选的，所述的shrna包含seqid no：5和/或6所示的核酸。

37、优选的，所述的shrna包含针对seq id no：7设计的shrna。

38、进一步优选的，所述的shrna包含seqid no：8和/或9所示的核酸。

39、优选的，所述的shrna包含针对seq id no：10设计的shrna。

40、进一步优选的，所述的shrna包含seqid no：11和/或12所示的核酸。

41、在本发明的一个具体实施方式中，所述的shrna包含针对seq id no：4设计的shrna，所述的shrna包含seqid no：5和/或6所示的核酸。

42、本发明的第十二方面，提供一种包含上述shrna的载体。

43、优选的，所述载体包括抑制cldn5表达的shrna腺相关病毒。

44、优选的，所述的腺相关病毒中克隆有针对seq id no：4设计的shrna。

45、进一步优选的，所述的shrna包含seqid no：5和/或6所示的核酸。

46、优选的，所述的腺相关病毒中克隆有针对seq id no：7设计的shrna。

47、进一步优选的，所述的shrna包含seqid no：8和/或9所示的核酸。

48、优选的，所述的腺相关病毒中克隆有针对seq id no：10设计的shrna。

49、进一步优选的，所述的shrna包含seqid no：11和/或12所示的核酸。

50、在本发明的一个具体实施方式中，所述的腺相关病毒中克隆有针对seq id no：4设计的shrna，所述的shrna包含seqid no：5和/或6所示的核酸。

51、本发明的第十三方面，提供一种上述shrna腺相关病毒或shrna在抑制cldn5表达中的用途。

52、本发明的第十四方面，提供一种上述shrna腺相关病毒或shrna在制备认知障碍相关疾病模型中的用途。

53、本发明的第十五方面，提供了一种筛选治疗认知障碍相关疾病的药物的方法。

54、优选的，所述的方法包括将候选药物施用于认知障碍相关疾病的动物模型，筛选能够使cldn5基因或蛋白表达升高的候选药物。

55、该方法可以为治疗目的，也可以为非治疗目的，该方法只是筛选哪些药物可以用于治疗认知障碍相关疾病，即治疗效果不是必然的。药物的筛选只是一种可能性。

56、在本发明的第十六方面，提供了一种诊断试剂盒。

57、优选的，所述的诊断试剂盒包括特异性检测cldn5基因和/或其表达产物的试剂，可用于认知障碍相关疾病的监测。

58、根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性引物和/或探针，可用于检测cldn5或其表达产物的含量。除引物和/或探针之外，还配有检测基因或蛋白表达的其他常用试剂，包括用于聚合酶链式反应的缓冲液，用于蛋白表达量检测的sds-page检测溶液等。

59、本发明所述的“产品”包含检测生物标志物的试剂。包括但不限于药物、试剂盒、设备等等。

60、本发明术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。

61、本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。

62、本发明所述的“治疗”，表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

63、本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的药物的量或剂量。

64、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

65、本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

66、本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。

67、本发明的有益技术效果：

68、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种cldn5基因在认知障碍相关疾病诊断和治疗中的用途。

69、本发明发现，认知障碍相关疾病（例如应激性认知障碍）模型小鼠pfc内皮细胞中，cldn5 mrna及表达产物水平发生了明显的缺陷，且cldn5基因表达与认知功能呈正相关性；使用特异性靶向cldn5的重组腺相关敲减病毒（aav-shcldn5）可显著特异性抑制内皮细胞cldn5的表达，加速认知功能障碍的进程；在小鼠pfc表达外源性cldn5可对抗应激的认知损伤作用，在治疗应激致认知功能损伤方面具有潜在应用价值。