大豆Glyma.17G065500抗病基因的用途

本发明涉及基因工程，特别涉及大豆glyma.17g065500抗病基因及其编码的蛋白质gmcbp60b与合成方法。

背景技术：

1、大豆起源于中国，已有5000年的种植史，是植物蛋白与食油的重要来源，在我国食品行业和食品加工业中占有重要的地位。随着社会经济的发展和居民饮食结构的优化，我国对大豆的需求量不断上涨，然而病虫害会导致大豆产量严重下降。因此提高大豆抗病性是迫切和必要的，而了解大豆免疫信号通路是提高大豆抗病性的基础。植物免疫系统的建立依赖于免疫相关基因的表达变化，基因的表达需要转录因子的调控。cbp60家族是植物中特有的一类转录因子家族，能够调节免疫相关基因的表达。在拟南芥中，cbp60家族共有8个成员：cbp60a-g以及sard1。其中cbp60g和sard1是防御反应的转录正调控因子，能激活水杨酸生物合成相关基因的表达，如ics1、eds5以及pbs3等；水杨酸是植物中与抗病性密切相关的一种内源激素，对病原体相关分子模式触发的免疫(pathogen-associated molecularpattern(pamp)-triggered immunity,pti)、效应子触发的免疫(effector-triggeredimmunity,eti)及sar均至关重要。而cbp60a是转录负调控因子，负调控免疫反应；与sard1、cbp60g不同，cbp60b兼具正、负调控免疫反应的功能。即细胞中cbp60b的水平可被r蛋白监控，其水平必须保持在一定范围内，超过此范围即可被r蛋白监测到，并激活eti。

2、目前为止对于cbp60b在免疫中的功能报道仅限于模式植物拟南芥中，在其它作物中的研究并未见报道。

3、大豆glyma.17g065500的序列信息在phytozome网站(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中被公开，其目前已知的用途是一种钙调素结合蛋白，在对抗胁迫中起作用。

4、此前有研究表明，glyma.07g028600基因的突变导致了角质层中蜡质的成分比例发生了很大的变化，同时又影响了角质的发育。

5、glyma.02g142500基因在gmsp1突变体中功能缺失导致果荚长度降低、果荚重量减少、荚皮空间缩小、叶片细胞数量减少、导致种子扁平、种子重量降低。

6、cn113862282a的发明《大豆pcl同源基因编辑位点及其应用》告知：pcl-qm在四个同源基因上的具体变异情况为：glyma.0900g0597(pcl-09g)在靶点处插入单碱基g；

7、glyma.13g100500(pcl-13g)在靶点处插入单碱基c；glyma.15g166200(pcl-15g)在靶点处缺失单碱基g和glyma.17g05940(pcl-17g)在靶点处缺失7bp gggccaa。突变体在调节大豆生长发育状态和提高大豆单株产量方面具有潜能。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种大豆glyma.17g065500抗病基因的新用途。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供一种大豆glyma.17g065500抗病基因的用途，用于提高大豆的抗病性能；所述大豆glyma.17g065500抗病基因cdna核苷酸的序列如seqid no：1所述。

3、作为本发明的大豆glyma.17g065500抗病基因用途的改进：所述抗病包括抗假单胞杆菌(pst dc3000)。

4、说明：假单胞杆菌属于细菌。

5、本发明还同时提供了一种制备能提高大豆的抗病性能的转基因烟草的方法：过表达大豆glyma.17g065500基因，获得过表达gmcbp60b转基因烟草，大豆glyma.17g065500抗病基因cdna核苷酸的序列如seq id no：1所述。所述抗病包括抗假单胞杆菌(pst dc3000)。

6、即，本发明还同时提供了构建过表达glyma.17g065500克隆载体以及制备过表达glyma.17g065500转基因烟草的方法：

7、本发明中：

8、大豆glyma.17g065500抗病基因的cdna核苷酸的序列如seq id no：1所述。

9、大豆glyma.17g065500抗病基因编码的蛋白质gmcbp60b的氨基酸序列如seq idno：2所述。

10、大豆glyma.17g065500抗病基因的合成方法为：提取野生型大豆的rna，将rna反转录为cdna，再以cdna为模板，以下述序列为引物，通过rt-pcr获得glyma.17g065500的基因序列，所述引物的序列为：

11、glyma.17g065500-f：aaaggtaccatgaagaaaccaacaa

12、glyma.17g065500-r：ttttctagattattcatctaactcctctatctg

13、本发明还提供了一种用基因合成的相同方法验证植株中glyma.17g065500的表达效果。

14、本发明利用基因诱导技术，在烟草中过表达大豆glyma.17g065500基因，验证其增强烟草抗病的能力，改良抗病性状。

15、本发明的glyma.17g065500编码的是转录因子gmcbp60b，其主要参与的途径是促进免疫及水杨酸合成相关基因的表达。

16、众所周知大豆转化困难，为了了解glyma.17g065500编码的蛋白gmcbp60b在抗病中的作用并克服大豆转化困难这一困境，本发明创制了过表达glyma.17g065500的转基因烟草株系。表明大豆glyma.17g065500编码的蛋白gmcbp60b参与了烟草的免疫反应。

17、本发明的有益效果：大豆glyma.17g065500抗病基因提高了烟草抗病性能；大豆glyma.17g065500抗病基因的合成方法简单，合成效率高，可以实现工业化生产。

18、综上，本发明创制了过表达glyma.17g065500基因的转基因烟草，验证其增强转基因烟草的抗病能力；过表达glyma.17g065500导致烟草自体免疫激活的表型，如烟草叶片上出现自发性细胞死亡、病程相关基因(pathogenesis-related genes,pr)的表达显著上调、水杨酸(salicylic acid,sa)过量积累以及对假单胞杆菌(pseudomonas syrangaepv.tomato dc3000,pst dc3000)的抗性显著增强；glyma.17g065500编码的蛋白gmcbp60b定位于细胞核中，可能能与gmsard1启动子区的核心基序(a/t)aatt结合并激活luc报告基因的表达。

19、需要说明的是：发明人所在团队早年申请的发明2020107671962《大豆glyma.04g016500.1抗病基因的用途》告知的抗病包括抗大豆斑点病菌(psg)、抗大豆花叶病毒(smv)。大豆斑点病菌属于细菌。本发明的glyma.17g065500与glyma.04g016500.1的同源性仅仅为34％，且假单胞菌和大豆斑点病菌(psg)虽然都是细菌，但假单胞菌是番茄中的一种细菌，而大豆斑点病菌是寄生于大豆中的一种细菌。因此该专利不能提供本发明以技术启示。