基于黄精转录组序列开发的EST-SSR分子标记及其应用

本发明属于基因工程，涉及基于黄精转录组序列开发的黄精属植物表达序列标签-ssr(est-ssr)分子标记开发及其应用，特别是涉及est-ssr分子标记辅助药用植物种质资源鉴定及其在黄精属种质资源遗传多样性研究中的应用。

背景技术：

1、黄精是中国特有的传统中草药。全球约有黄精属植物40余种，我国约有黄精属植物30余种。据2020年版《中华人民共和国药典》所规定，药材黄精为黄精(polygonatumsibiricum red.)、滇黄精(p.kingianum coll.et hemsl)及多花黄精(p.cyrtonema hua)的干燥根状茎。黄精主要分布于黑龙江、吉林、河北等省份；滇黄精主要分布于四川、云南及贵州；多花黄精主要分布于四川、贵州、湖南等省份。

2、黄精具有药食同源性且黄精多糖等成分药理作用众多，因此在保健、医疗、食品等领域的需求量逐年递增。然而由于掠夺性的采挖、生长环境的人为干扰及自然环境的变化，导致黄精种质资源生长环境遭到破坏，野外难以寻觅，濒于灭绝，因此选育黄精优良品种的工作迫在眉睫。选育黄精优良品种，可改善黄精主栽品种混乱，种性退化等问题，可解决日益增长的市场需求和促进黄精产业的健康可持续发展。黄精属植物分布广泛且遗传多样性丰富，黄精潜在可利用资源丰富，利用分子标记分析黄精种质资源的遗传多样性，有助于推进黄精优良品种的选育工作。

3、分子标记是根据个体或种群间的核苷酸序列的差异作为遗传标记，直观明了地从dna水平上反映出生物的多样性，具有多态性高、稳定好等优点，已广泛应用于中药材辅助育种工作中。近年来，已有较多科研人员将各种分子标记技术应用在黄精属植物遗传多样性、种质资源的鉴定和辅助育种等研究领域。姜武等【姜武,李亚萍,陈家栋,陶正明.基于issr和srap分子标记的黄精种质遗传多样性研究[j].中草药,2022,53(21):6865-6873.】选用14条简单重复序列(inter simple sequence repeat，issr)和11对相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism，srap)对4个居群22个种源47份黄精种质资源进行多态性检测、遗传多样性比较和聚类分析，揭示黄精种质的遗传多样性及地理分布特征。陈浩等【陈浩,钱华丽,徐哲,苏建云,陈小磊,季鹏章.滇黄精转录组ssr位点信息分析[j].北方园艺,2022(22):104-109.】对滇黄精转录组进行测序并采用microsatellite(misa)软件检索出滇黄精的简单序列重复(simple sequence repeat，ssr)位点，以及设计ssr基序引物，为滇黄精遗传连锁图谱的绘制、优良品种的辅助育种、种间的分子鉴别等研究提供了参考依据。刘跃均等【刘跃钧,张媛,蒋燕锋,刘京晶.黄精种质资源遗传多样性研究[j].浙江农林大学学报,2016,33(06):1085-1091.】通过目标起始密码子多态性分子标记(scot)方法，采用非加权平均距离法(upgma)和主坐标分析(pcoa)等方法对19份不同种源的黄精材料进行分析，为中药黄精优良品种的培育及资源可持续利用提供研究基础。

4、ssr标记具有共显性、高度重复性、多态性好、稳定可靠、经济方便等优点，然而黄精属ssr分子标记开发缓慢，目前虽已公布的ssr分子标记数已有97个，但能够利用的黄精属ssr分子标记数量非常有限，前人对黄精属遗传多样性的研究或是材料太少或是ssr引物太少或是在不同种黄精属植物中不具有通用性，因而缺乏代表性。

技术实现思路

1、为此，需要提供一种更具代表性的鉴定黄精属种质资源的est-ssr分子标记，用于黄精属种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种群的亲缘关系及演化和遗传育种。

2、为实现上述目的，发明人提供了如下技术方案：

3、基于黄精转录组序列开发的est-ssr分子标记，所述的est-ssr分子标记包括以下9对est-ssr引物的组合：

4、

5、所述的est-ssr引物的开发方法为：选取3个黄精属不同种的样本进行转录组测序；基于转录组测序结果，分析筛选出在黄精近缘种中具多态性的est-ssr位点；挑选出尽量多的引物对，对大样本进行检测，进一步筛选获得最能区分不同黄精属品种的特异性est-ssr引物组合。

6、进一步的，所述的基于黄精转录组序列开发的est-ssr分子标记在黄精属种质资源遗传多样性分析中的应用。

7、进一步的，所述的黄精属种质资源包括鸡头黄精、长梗黄精、滇黄精或多花黄精。

8、进一步的，所述的分析方法包括以下步骤：

9、(1)dna提取：提取待鉴定黄精种质的基因组dna；

10、(2)dna扩增：以提取的dna为模板，利用所述的9对est-ssr引物进行pcr扩增反应；pcr反应程序为：93-98℃预变性4-6min；93-98℃变性25-35s，62-52℃梯度退火25-35s，70-75℃延伸25-35s，运行10-12个循环；93-98℃变性25-35s，50-55℃退火25-35s，70-75℃延伸25-35s，运行23-28个循环；70-75℃延伸20-25min，最后2-8℃保存；

11、优选的，pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62-52℃梯度退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环；72℃延伸20min，最后4℃保存；

12、(3)电泳检测：扩增产物经毛细管电泳检测，使用genemarker软件对结果进行分析，获得每个样品的等位基因数、峰图和基因型；

13、(4)数据分析：整理基因型数据，将电泳图上可重复的、易分辨的条带记为“1”，同一位置无带计为“0”；利用ntsys软件计算遗传相似系数，并采用非加权配对算术平均法upgma进行遗传相似性聚类分析。遗传相似性系数越大，亲缘关系越接近。

14、进一步的，所述的基于黄精转录组序列开发的est-ssr分子标记在黄精属种质资源遗传图谱构建中的应用。

15、进一步的，所述的基于黄精转录组序列开发的est-ssr分子标记在黄精属药用植物遗传育种中的应用。

16、进一步的，所述的基于黄精转录组序列开发的est-ssr分子标记在黄精属种质及道地性道地性鉴定中的应用。

17、本发明的有益效果是：

18、(1)与传统ssr不同，est-ssr来源于转录区域，可直接反映相关基因的多样性，其通用性和保守性比基因组ssr高。

19、(2)基于est-ssr分子标记技术，可从分子水平对来自贵州、河南、湖南、云南、福建等地的黄精属种质的遗传多样性进行研究，为黄精属药用植物的种质资源鉴定、科学保护和优良品种的分子辅助育种提供一定参考；还可以为药材的道地性鉴定提供较为准确的方法，从而为中药材品质的评价提供参考。

20、(3)利用本方法可有针对性选择具有优良性状亲本并进行基因型鉴别，对进一步利用分子标记缩短育种年限有现实意义。