一种靶向受损胰腺组织的适配体及适配体工程化修饰外泌体的构建以及应用

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种靶向受损胰腺组织的适配体及适配体工程化修饰外泌体的构建以及应用。

背景技术：

1、糖尿病和胰腺癌同属于胰腺相关疾病，具有多方面的联系。糖尿病大多是胰腺内分泌细胞胰岛素分泌出现问题所致,而胰腺癌多是由胰腺外分泌结构恶变而来。胰腺癌的发生发展可导致胰腺受损从而导致血糖升高并发生糖尿病，而糖尿病患者由于胰腺长期的高糖毒性影响也将导致胰腺癌的发生。

2、糖尿病主要是因为胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足或胰高血糖素分泌过多而引起的一种慢性代谢性疾病，主要分为1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病以及其他类型。目前糖尿病的治疗手段包括饮食治疗、药物治疗等方式，早期可以通过科学饮食控制血糖水平对糖尿病进行预防控制，后期则需要进行药物治疗或者胰岛移植手术。治疗糖尿病的常见药物有：胰岛素促泌剂(格列奈类、磺酰脲类等)、胰岛素增敏剂(双胍类等)、胰岛素及其类似物等。但是长期的药物治疗很可能导致胰岛素抵抗的发生或是胰岛功能下降乃至丧失，而胰岛移植也存在着供体短缺以及免疫排斥等问题。

3、根据globocan 2020年的估计，胰腺癌导致约466003人死亡，同年约有495773人患有胰腺癌，是癌症死亡的第七大原因，也是常见的癌症之一。到目前为止胰腺癌的病因仍不清楚，但可以确定某些危险因素如吸烟、肥胖、家族病史、糖尿病等与胰腺癌的发生发展存在一定的关系。目前胰腺癌的治疗手段主要包括手术、化疗、免疫疗法等。手术是目前胰腺癌患者唯一可能治愈的治疗方法，但只有大约百分之二十的患者似乎达到了可疑的“治愈”。即使进行手术后胰腺癌的复发率仍然很高，因此，化疗通常也是患者术后的必然选择。吉西他滨及其他药物的组合通常用于胰腺癌化疗，是fda批准用于治疗胰腺癌患者的第一种药物，其抗癌机制主要是通过产生抑制核糖核苷还原酶和阻断dna合成的代谢物；另外5-氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂和亚叶酸钙的联合治疗相对有效，是胰腺癌患者的标准疗法，但也存在疲劳、胃肠道疾病、骨髓抑制等一些副作用。

4、外泌体是由细胞分泌的一种双层脂质囊泡，最初被认为是细胞排泄的废物，后续研究发现外泌体可参与细胞通讯等多种生理过程。而干细胞衍生的外泌体具有先天的治疗潜力，可在多种疾病的治疗中发挥作用。研究表明间充质干细胞(msc)的治疗效果可能主要是由于其内分泌和旁分泌作用，而细胞分泌的外泌体携带关键的信号分子，是干预疾病的潜在生物制剂；同时外泌体也是天然的内源性载体，作为药物载体外泌体具有很大的优势。但是在用于治疗时，外泌体的体内分布缺乏一定的靶向性，用量较大。

5、适配体(aptamer)一般是指通过指数富集配体系统进化技术(selex)筛选到的，能特异性结合靶标的寡核苷酸序列，一般是单链dna或者rna片段。核酸适配体可以折叠形成稳定的三维空间结构，并通过范德华力、氢键、碱基堆积力等特异性地与小分子化合物、蛋白等靶标分子结合。

6、适配体的筛选可以针对多种靶标进行，如目前针对cd34阳性眼眶成纤维细胞、人胶质瘤细胞或是结直肠癌血清开展的筛选，但是，目前针对受损胰腺的筛选尚未开展，另一方面，已有的研究表明外泌体有助于恢复受损胰腺功能，但是缺乏相关的特异性。

技术实现思路

1、为此，需要提供一种靶向受损胰腺组织的适配体、外泌体和制备方法与应用，解决现有外泌体对受损胰腺缺乏相关的特异性的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种靶向受损胰腺组织的适配体，适配体的序列为以下中的一种：

3、

4、

5、一种靶向受损胰腺组织的适配体的筛选方法，包括：(1)合成构建初始文库，初始文库为初级筛选文库；

6、(2)正向筛选：培养胰腺癌细胞capan-1，加入筛选文库，混匀孵育，孵育结束后，洗涤，刮取ssdna-capan-1细胞复合物,筛选轮数为n,此时,n＝1；

7、(3)提取ssdna-capan-1细胞复合物中的ssdna，并将其进行pcr扩增纯化制备次级文库，以次级文库作为筛选文库返回步骤(2)进行循环筛选，此时,n＝n+1；

8、(4)设定筛选轮数为m，m为正整数，当筛选轮数满足n≥m时，输出步骤(3)分离的ssdna，即为筛选的靶向受损胰腺组织的适配体。

9、在一些实施例中，当n≥4时，在正向筛选之前增加反向筛选，步骤(3)ssdna扩增后，以次级文库作为筛选文库返回进行反向筛选、正向筛选的循环，

10、反向筛选：将加入筛选文库加入到反筛细胞中，混匀孵育，孵育结束后，取上清液，所述反筛细胞为结肠癌细胞hct-15和/或肝癌细胞bel-7402。

11、在一些实施例中，随着筛选轮数n的增加，逐渐增加筛选压力，增加筛选压力的方式包括：

12、降低正向筛选的培养皿面积、正向筛选孵育时间；

13、增大反向筛选的培养皿面积、反向筛选孵育时间；

14、在筛选时不断减少筛选文库的使用量。

15、一种靶向受损胰腺组织的工程化外泌体，如权利要求1所述的适配体与细胞分泌的外泌体偶联。

16、在一些实施例中，所述细胞分泌的外泌体为人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。

17、一种靶向受损胰腺组织的工程化外泌体的制备方法，包括：

18、(1)对适配体进行胆固醇修饰；

19、(2)将胆固醇修饰后的适配体与外泌体混匀，避光孵育；

20、(3)孵育完成后，离心沉淀分离得到工程化外泌体。

21、在一些实施例中，步骤(2)中，外泌体：适配体＝20μg：0.5-1nmol。

22、上述的靶向受损胰腺组织的适配体的应用，其特征在于，所述适配体通过偶联治疗药物应用于制备靶向胰腺疾病的药物。

23、上述的工程化外泌体的应用，所述工程化外泌体应用于制备靶向胰腺疾病的药物。

24、上述的某一技术方案具有以下有益效果：

25、本发明针对胰腺细胞进行筛选，获得可特异性结合到受损胰腺的适配体，同时体内实验验证其对受损胰腺具有良好的靶向性。在筛选获得上述靶向受损胰腺的适配体后，便将之应用于修饰外泌体，由于外泌体具有促进胰岛再生的作用，同时也是良好的生物载体，因此由本发明构建出的工程化外泌体，具有靶向胰腺组织的能力，从而使外泌体可以更好的分布到受损胰腺部位，因此本发明的适配体和工程化外泌体可以应用于靶向胰腺疾病的药物的制备。

26、术语说明

27、需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

28、本发明中“室温”、“常温”指的是环境温度，温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”或“常温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另一些实施例中，“室温”或“常温”指的是温度由大约25℃到大约30℃；在又一些实施例中，“室温”或“常温”指的是10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等。

29、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。