人星形胶质细胞的高效诱导方法

本发明涉及神经生物学领域，具体涉及一种人星形胶质细胞的高效诱导方法。

背景技术：

1、人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hpscs)包括人胚胎干细胞(humanembryonic stem cell，hescs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stemcells,hipscs)，这些干细胞为科学进步，生物医学研究和药物开发提供了前所未有的机会。hescs和hipscs可以不断的自我更新，并具有向三个胚层分化的潜力。因此，这些人多能干细胞被认为是治疗变性，恶性，遗传疾病或由于炎症，感染和创伤引起的损伤的可能手段。同时，hesc和hipsc是研究和模拟人类早期发育(正常和异常)并了解诸如细胞增殖，分化和细胞可塑性等基本生物学问题的宝贵研究工具。此外，它们可以作为开发和测试新药的平台。为了充分发挥hescs和hipscs的潜力，最关键的一步是高效地将多能干细胞定向分化为特定谱系的细胞类型。

2、现有技术中，星形胶质细胞通常是从人多能干细胞开始诱导分化为星形胶质细胞获得的，该过程周期往往较长。例如，从ipsc体外诱导分化星形胶质细胞的方法较多(emdadet al.,2012；juopperi et al.,2012；krencik and ullian,2013；roybon et al.,2013；shaltouki et al.,2013)，这些方法往往耗时较长且难以获得功能性的星形胶质细胞。zhang等人发现大脑中星形胶质细胞存在两种分明的状态：一种是具有增值性的星形胶质细胞前体状态，另一种是非增殖的，成熟的星形胶质细胞(zhang et al.,2016)。pasca团队利用类脑器官技术，将人多能干细胞建立类脑器官，通过590天的长时间的分化，发现了星形胶质细胞存在增殖到成熟状态的转变(solan et al.,2017)。从神经前体细胞起始分化星形胶质细胞，是相对更节省分化时间的方法，在已报道的方法中，时间为30天左右(tcwet al.，2017)。以上星形胶质细胞体外分化的方法都具有耗时较长的特点，

3、因此，本领域迫切需要开发一种人星形胶质细胞的高效诱导方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种人星形胶质细胞的高效诱导方法。

2、在本发明的第一方面，提供了一种制备神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群的方法，包括步骤：

3、(1)提供一前体细胞；和

4、(2)在适合上述前体细胞分化为神经细胞和星形胶质细胞前体的条件下，在经包被的培养介质中培养时间t1，从而获得含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群，其中，所述培养时间t1为8-30天，

5、在含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群中，神经细胞在细胞总数中的占比为c1，星形胶质细胞前体在细胞总数中的占比为c2，其中c1：c2＝(70％-98％)：(1％-10％)。

6、在另一优选例中，所述前体细胞能够分化为神经细胞和星形胶质细胞前体；优选地为人神经细胞和人星形胶质细胞前体。

7、在另一优选例中，所述前体细胞来源于人多能干细胞(hpsc)、人胚胎干细胞(hesc)、诱导多能干细胞(ipsc)、神经干细胞(nsc)。

8、在另一优选例中，所述前体细胞来源于诱导神经干细胞(insc)。

9、在另一优选例中，所述前体细胞为人神经前体细胞，如人脊髓神经前体细胞。

10、在另一优选例中，(2)中，适合人神经前体细胞分化为神经细胞和星形胶质细胞前体的条件包括：在rock抑制剂的存在下培养。

11、在另一优选例中，(2)中，适合人神经前体细胞分化为神经细胞和星形胶质细胞前体的条件包括：在含6-12μm rock抑制剂的第一培养基的培养体系中，培养人神经前体细胞。

12、在另一优选例中，所述第一培养基为：不含vitamin a的n2b27培养液。

13、在另一优选例中，所述经包被的培养介质为用matrigel包被的细胞培养板。

14、在另一优选例中，所述rock抑制剂为y27632。

15、在另一优选例中，人神经前体细胞的接种密度为1×103-2×105/cm2，较佳地5×103-8×104/cm2；更佳地1×104-2×104/cm2。

16、在另一优选例中，(2)中，所述培养时间t1为10-25天，更佳地12-20天。

17、在另一优选例中，(2)中，所述含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群中，神经细胞在细胞总数中的占比为c1，星形胶质细胞前体在细胞总数中的占比为c2，其中c1：c2＝(40％-95％)：(2％-18％)；更佳地c1：c2＝(30％-90％)：(3％-30％)。

18、在本发明的第二方面，提供了一种培养星形胶质细胞前体的方法，包括步骤：

19、(1)提供一含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群；

20、(2)对(1)中的混合细胞群进行消化处理，获得经消化的混合细胞群，所述经消化的混合细胞群包含悬浮状态的单个神经细胞和单个星形胶质细胞前体；

21、(3)在第二培养基的培养体系中，将经消化的混合细胞群接种于未包被的培养介质中，贴壁培养t2时间，从而使得星形胶质细胞前体贴壁于所述培养介质，其中t2为10-24h；

22、(4)将所述培养体系中贴壁的星形胶质细胞前体与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养介质贴壁的星形胶质细胞前体进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁星形胶质细胞前体，其中星形胶质细胞前体在细胞总数中的占比为70-95％；和

23、(5)对上一步骤获得的经分离的贴壁星形胶质细胞前体进行扩增培养，获得稳定连续传代的人星形胶质细胞前体。

24、在另一优选例中，所述含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群由本发明的第一方面的方法制备。

25、在另一优选例中，所述未包被的培养介质为未包被的细胞培养皿或培养瓶。

26、在另一优选例中，(1)中，所述混合细胞群的密度为1×104-2×107个细胞/cm2。

27、在另一优选例中，(2)中，消化处理包括加入细胞消化液(例如accutase)，在37度消化3-10分钟。

28、在另一优选例中，(3)中，所述经消化的混合细胞群的接种密度为1×105-1×106个细胞/ml。

29、在另一优选例中，所述第二培养基为不含vitamin a的n2b27培养液。

30、在另一优选例中，所述第二培养基中不包含转分化过表达转录因子(如nf1a)。

31、在另一优选例中，所述t2为11-20h，更佳地为12h。

32、在另一优选例中，(4)中，所述经分离的贴壁星形胶质细胞前体具有选自下组的一种或多种特征：

33、有70％以上，优选75％以上，最优选85％以上的细胞表达星形胶质细胞前体标志基因s100β；

34、有70％以上，优选75％以上，最优选85％以上的细胞表达星形胶质细胞前体标志基因nfia。

35、在另一优选例中，(5)中，包括步骤：

36、消化上述步骤中获得的经分离的贴壁星形胶质细胞前体，以10000-50000/cm2的密度将细胞接种于包被matrigel的培养皿中，在第三培养基中传代培养，获得稳定连续传代的人星形胶质细胞前体。

37、在另一优选例中，所述第三培养基为不含vitamin a的n2b27培养液，其中包含5-25ng/ml egf、5-25ng/ml bfgf，更佳地，10 -20ng/ml egf、10-20ng/ml的bfgf。

38、在另一优选例中，(5)中，所述的传代培养为至少培养10代，较佳地，至少20代，更佳地，至少30-40代。

39、在本发明的第三方面，提供了一种从含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群中分离星形胶质细胞前体的方法，包括步骤：

40、(1)提供一含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群；

41、(2)对(1)中的混合细胞群进行消化处理，获得经消化的混合细胞群，所述经消化的混合细胞群包含悬浮状态的单个神经细胞和单个星形胶质细胞前体；

42、(3)在第二培养基的培养体系中，将经消化的混合细胞群接种于未包被的培养介质中，贴壁培养t2时间，从而使得星形胶质细胞前体贴壁于所述培养介质，其中t2为10-24h；和

43、(4)将所述培养体系中贴壁的星形胶质细胞前体与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养介质贴壁的星形胶质细胞前体进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁星形胶质细胞前体，其中星形胶质细胞前体在细胞总数中的占比为70-95％。

44、在本发明的第四方面，提供了一种星形胶质细胞前体，所述星形胶质细胞前体由以下的方法制备：

45、(1)提供一前体细胞；

46、(2)在含6-12μm rock抑制剂的第一培养基的培养体系中，培养人神经前体细胞，在经包被的培养介质中培养时间t1，从而获得含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群，其中，所述培养时间t1为10-30天，更佳地，12-18天；

47、其中，在含有神经细胞和星形胶质细胞前体的混合细胞群中，神经细胞在细胞总数中的占比为c1，星形胶质细胞前体在细胞总数中的占比为c2，其中c1：c2＝(70％-98％)：(1％-10％)；

48、(3)对(1)中的混合细胞群进行消化处理，获得经消化的混合细胞群，所述经消化的混合细胞群包含悬浮状态的单个神经细胞和单个星形胶质细胞前体；

49、(4)在第二培养基的培养体系中，将经消化的混合细胞群接种于未包被的培养介质中，贴壁培养t2时间，从而使得星形胶质细胞前体贴壁于所述培养介质，其中t2为10-24h；

50、(5)将所述培养体系中贴壁的星形胶质细胞前体与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养介质贴壁的星形胶质细胞前体进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁星形胶质细胞前体，其中星形胶质细胞前体在细胞总数中的占比为70-95％；和

51、(6)对上一步骤获得的经分离的贴壁星形胶质细胞前体进行扩增，获得稳定连续传代的人星形胶质细胞前体。

52、在另一优选例中，所述神经前体细胞的接种密度为1×103-2×105/cm2，较佳地5×103-8×104/cm2；更佳地1×104-2×104/cm2。

53、在另一优选例中，所述星形胶质细胞前体具有选自下组的一种或多种特征：

54、有70％以上，优选75％以上，最优选85％以上的细胞表达星形胶质细胞前体标志基因s100β；

55、有70％以上，优选75％以上，最优选85％以上的细胞表达星形胶质细胞前体标志基因nfia。

56、在本发明的第五方面，提供了一种星形胶质细胞的制备方法，包括步骤：

57、(1)提供一如本发明的第四方面所述的星形胶质细胞前体；

58、(2)在第三培养基中，培养(1)中的细胞，培养时间t3，获得星形胶质细胞。

59、(2)在第四培养基中，在经包被的培养介质中培养(1)中的细胞，培养时间t3，获得星形胶质细胞。

60、在另一优选例中，所述第四培养基为不含vitamin a的n2b27培养液，其中包含5-25ng/ml egf、5-25ng/ml bfgf、10-30ng/ml cntf。

61、在另一优选例中，(1)中，星形胶质细胞前体的密度为1000-10000/cm2；较佳地2000-5000/cm2。

62、在另一优选例中，(2)中，培养时间t3为6-30天，较佳地17-19天，更佳地18天。

63、在另一优选例中，所述经包被的培养介质为用matrigel包被的培养板或培养皿。

64、在另一优选例中，所述成熟星形胶质细胞具有选自下组的一种或多种特征：

65、有80％以上，优选90％以上，最优选95％以上的细胞表达星形胶质细胞表达成熟标志物eaat1；

66、有80％以上，优选90％以上，最优选95％以上的细胞表达星形胶质细胞表达成熟标志物eaat2。

67、在本发明的第六方面，提供了一种星形胶质细胞，所述星形胶质细胞由本发明的第五方面所述的方法制备。

68、在本发明的第七方面，提供了一种如本发明的第四方面所述的星形胶质细胞前体或如本发明的第五方面所述的星形胶质细胞的用途，用于制备一种预防或治疗脊髓损伤(spina cord injury，sci)相关疾病的药物组合物。

69、在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

70、(1)有效量的如本发明的第四方面所述的星形胶质细胞前体或如本发明的第五方面所述的星形胶质细胞；和

71、(2)药学上可接受的载体。

72、在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂、冻干制剂、干细胞制剂、细胞模型。

73、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。