GelMA-卡拉胶水凝胶墨水和GelMA-卡拉胶双交联水凝胶及其制备方法与应用

本发明属于水凝胶材料、3d打印制造和医疗器械领域，具体涉及一种gelma-卡拉胶水凝胶墨水和gelma-卡拉胶双交联水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、3d打印技术的出现正在推动功能性组织替代物设计的革命。3d打印已被证明是一种构建异质组织结构的强大的技术，融合了生物材料科学、计算机辅助和装备制造业，可以在精确控制支架外部形态的同时兼顾内部细微的孔隙结构，从而促成了许多生物医学应用中仿生组织的构建，如与实际组织(如耳朵、鼻子和气管)类似的精确形状控制，多种类型细胞和生物墨水的精确定位，以及血管化设计，促进了精准医疗的快速发展。

2、与医用金属、热塑性塑料、生物陶瓷等传统支架材料相比，水凝胶能够提供水环境，模拟细胞外基质，促进了营养的通透性，更有利于细胞的附着、生长和功能。因此，水凝胶基支架在组织工程中越来越受到重视。

3、明胶是胶原部分水解的产物，分子主链上含有促进细胞粘附的arg-gly-asp(rgd)肽序列，以及丰富的氨基酸组成，具有良好的生物相容性。gelma是一种经甲基丙烯酰基对明胶侧基改性后得到的衍生物。改性后的明胶在保有生物活性的同时，克服了不稳定易水解的缺点，此外侧基上的双键还赋予了gelma多样的加工方法。因其兼具良好的生物相容性和生物活性，gelma已被广泛应用于可挤出生物墨水配方中。

4、卡拉胶是一种从红海藻中提取的天然硫酸酯多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等诸多生物活性，因此被广泛应用于生物医用材料领域。根据硫酸盐含量、提取来源和溶解度，卡拉胶被分为kappa(κ)、iota(ι)、mu(μ)、nu(ν)、theta(θ)和lambda(λ)六大类别，其中kappa和iota两种类型的卡拉胶应用最为广泛。卡拉胶溶液具有温敏性，随温度的变化可以可逆地形成热致凝胶，并且可以通过引入金属离子作为离子交联剂增强凝胶性能。

5、gelma水凝胶粘度低、质软的缺陷限制了gelma水凝胶墨水在生物3d打印中的进一步发展，限制了其应用领域。目前，有方法将卡拉胶掺入gelma水凝胶中以改善水凝胶体系的力学性能，但上述方法大多将卡拉胶作为增强增粘助剂，忽视了卡拉胶本身的生物特性。

6、因此，寻求一种利用卡拉胶实现gelma水凝胶墨水改性的新路径就成为了本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种具有良好生物3d打印性能的gelma-卡拉胶水凝胶墨水。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种gelma-卡拉胶水凝胶墨水，包括甲基丙烯酰化明胶、卡拉胶、水溶性光引发剂和溶剂，其中，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为4-20wt/v％、取代度为40-100％；所述卡拉胶的浓度为0.1-5wt/v％、类型为kappa型或iota型；所述水溶性光引发剂的浓度为0.01-1wt/v％；余量为溶剂。

4、值得说明的是，gelma有着剪切变稀、室温下自发成胶的性质，卡拉胶具备粘度大、力学性能好的特点，两者结合得到的gelma-卡拉胶双交联水凝胶前躯体流变学性能良好，室温下即可打印，而且保形能力强可用于多种精细结构的打印，具有良好3d打印性能。

5、进一步的，所述水溶性光引发剂包括2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、二苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰)氧磷中的一种或多种。

6、值得说明的是，所述光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮又称irgacure 2959光引发剂，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐又称lap光引发剂，二苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰)氧磷又称tpo光引发剂。

7、进一步的，所述溶剂为去离子水、ph在7.0-7.5的生理盐水、pbs溶液、磷酸盐缓冲溶液和含0％-20％血清的细胞培养基中一种或多种。

8、进一步的，所述gelma-卡拉胶水凝胶墨水中还包括活细胞。

9、值得说明的是，具有活细胞的gelma-卡拉胶生物墨水可通过3d打印技术制备应用于不同治疗部位、不同治疗需求的3d打印生物修复支架，包裹在凝胶体系中的活细胞可在修复过程中向靶点迁移，加速治疗过程。

10、本发明的第二个目的在于，提供一种经由如上所述gelma-卡拉胶水凝胶墨水制备得到的gelma-卡拉胶双交联水凝胶。

11、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

12、一种gelma-卡拉胶双交联水凝胶，包括4-20wt/v％的甲基丙烯酰化明胶，0.1-5wt/v％的卡拉胶，0.01-1wt/v％的光引发剂、溶剂和金属阳离子。

13、本发明通过引入金属阳离子作为离子交联剂，一方面促进了卡拉胶成胶而增强水凝胶整体体系的综合性能，另一方面金属阳离子进入水凝胶体系后也使水凝胶体系具备了特异性生物性能，使得包括金属阳离子的gelma-卡拉胶双交联水凝胶具有协同增效的性质。

14、进一步的，所述甲基丙烯酰化明胶的取代度为40-100％，所述卡拉胶的类型为kappa型或iota型，所述水溶性光引发剂包括2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐或二苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰)氧磷，所述金属阳离子包括钾离子、银离子、镁离子、钙离子、锶离子、钡离子、铁离子或锌离子，所述溶剂为去离子水、ph在7.0-7.5的生理盐水、pbs溶液、磷酸盐缓冲溶液和含0％-20％血清的细胞培养基中一种或多种。

15、值得说明的是，本发明中gelma作为水凝胶体系的主体，具有剪切变稀、低温自发成胶、加工方式多样的良好性质；卡拉胶为第二组分，不但增强了体系的力学性能，而且提供离子交联位点；通过引发gelma大分子的双键聚合，光引发剂可在紫外光下使gelma变为稳定的化学凝胶；金属阳离子渗入卡拉胶中显著增强卡拉胶的力学强度，且不同金属阳离子具备的特异性生物性能也同时被引入水凝胶体系中。

16、进一步的，考虑到单纯的gelma无法在不修饰配体的情况下引入金属离子，故而本发明将gelma与卡拉胶结合，并使金属阳离子通过促进卡拉胶成胶的方式以离子形态被吸纳入水凝胶体系，此时得到的水凝胶体系既被增强了力学性能，同时引入的金属阳离子也可以经缓释长效发挥其生物学性能，使得水凝胶体系也具备了相应的生物学活性。。

17、本发明的第三个目的在于提供一种如上所述gelma-卡拉胶双交联水凝胶的制备方法。

18、一种gelma-卡拉胶双交联水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

19、i、制备甲基丙烯酰化明胶：将明胶溶液与甲基丙烯酸酐进行反应，得到甲基丙烯酰化明胶；

20、ii、制备gelma-卡拉胶水凝胶墨水：将甲基丙烯酰化明胶溶液与卡拉胶溶液混合均匀，再与光引发剂溶液混合，得到gelma-卡拉胶水凝胶墨水；

21、iii、制备gelma-卡拉胶双交联水凝胶；将gelma-卡拉胶水凝胶墨水静置成胶，将所得凝胶经金属阳离子溶液交联和紫外光交联，得到gelma-卡拉胶双交联水凝胶。

22、值得说明的是，虽然现有技术已将卡拉胶掺入gelma水凝胶中以改善水凝胶体系的力学性能，但上述方法大多将卡拉胶作为增强增粘助剂，不会对卡拉胶进行交联，只是将卡拉胶共混在凝胶体系中，故而忽视了卡拉胶本身的特性。本发明利用卡拉胶可以离子交联的性质，通过紫外交联gelma和离子交联卡拉胶的双重交联手段将凝胶体系中的两种组分各自交联，得到综合性能良好的gelma-卡拉胶双交联水凝胶。并且，本发明还通过金属阳离子溶液交联引入了不同金属阳离子来赋予凝胶体系特异性的生物活性。

23、进一步的，所述步骤i中明胶溶液的ph为7.0-9.7，明胶与甲基丙烯酸酐添加比例为10g:(3-6)ml；所述步骤iii中，静置成胶的温度为4℃-30℃，金属阳离子溶液的浓度≥5w/v％，金属阳离子溶液交联的反应条件为完全浸没3-60分钟，紫外光交联的反应时间为3-60分钟。

24、进一步的，所述金属阳离子溶液中的阳离子包括钾离子、银离子、镁离子、钙离子、锶离子、钡离子、铁离子或锌离子，溶剂为去离子水或去钙、镁离子的pbs溶液。

25、更进一步的，所述步骤i制备甲基丙烯酰化明胶的方法为：在50℃搅拌条件下，将明胶完全溶解于水相体系中，再将甲基丙烯酸酐滴加到明胶溶液中，体系反应1-3小时，反应产物经离心、透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酰化明胶gelma。

26、更进一步的，所述步骤i中离心的离心机分离因数为3500-5000g，离心的时间为3-5分钟；透析为选用截留分子量为12-14kda的透析袋于40℃去离子水中透析4-7天；明胶的水相体系为去离子水、ph在7.0-7.5的生理盐水、pbs溶液、磷酸盐缓冲溶液和含0％-20％血清的细胞培养基中的一种或多种。

27、更进一步的，所述步骤ii中甲基丙烯酰化明胶溶液、卡拉胶溶液、光引发剂溶液的溶剂统一为去离子水、ph在7.0-7.5的生理盐水、pbs溶液、磷酸盐缓冲溶液和含0％-20％血清的细胞培养基中一种或多种。

28、且，步骤ii中各溶液的混合条件为温度50-55℃，避光条件下搅拌3-12小时，各溶液的储存条件为温度4-30℃，避光密封保存。

29、更进一步的，步骤iii中静置成胶的条件为温度4-30℃，避光密封静置。

30、本发明的第四个目的在于，提供如上所述gelma-卡拉胶水凝胶墨水或gelma-卡拉胶双交联水凝胶在制备组织修复、再生医学、生物医药和基础细胞生物学领域的3d打印材料方面的应用。

31、在一些实施例中，所述gelma-卡拉胶双交联水凝胶在3d打印中的应用的步骤如下：

32、(a)将所述gelma-卡拉胶双交联水凝胶墨水注入3d打印料筒，置于3d打印机的挤出装置中；然后导入模型，设置打印参数，将所述gelma-卡拉胶双交联水凝胶墨水挤出到打印平台上，得到初步固化的水凝胶支架；

33、(b)将所述水凝胶支架经金属阳离子溶液交联和紫外光交联固化，形成稳定的gelma-卡拉胶双交联水凝胶支架。

34、优选的，所述步骤(a)中3d打印料筒为棕色的光固化料筒；挤出装置与所述打印平台的温度为19-25℃；模型为根据具体应用所定的组织模型；打印参数包括：打印速率2-10mm/s，挤出压力0.15-0.5mpa。

35、优选的，所述步骤(b)中金属阳离子溶液和紫外光照交联固化时间为30-90分钟；紫外光的波长为320-500nm，功率密度为0.001-10w/cm2。

36、与现有技术相比，本发明首先在明胶上接枝上具有双键的活性基团，得到可经自由基引发剂固化的gelma；进一步将gelma、卡拉胶和自由基引发剂混合得到双交联水凝胶墨水，水凝胶墨水具有打印型强、打印精度高、自支撑能力好、保形能力强等特点，通过金属阳离子和紫外光照的两重交联固化，得到双交联水凝胶，gelma-卡拉胶双交联水凝胶不仅有良好的力学性能和生物相容性，还有金属阳离子赋予的特定生物性能。

37、并且，本发明中复合水凝胶墨水的两种组分均是具有良好生物相容性和生物特性的天然生物大分子，制备方法简单且几乎无生物毒性，两相结合后取长补短，将gelma良好的流动性和室温下成胶性与卡拉胶的较强的力学性能结合在一起，可实现软组织修复、神经组织修复、骨修复、3d打印等许多领域的应用。进一步的，本发明还通过引入金属阳离子的方式进一步提高水凝胶体系的力学性能，同时赋予水凝胶体系金属离子的生物学特性。