一种全自动离心微流控芯片及其制备方法与流程

本发明涉及微流控，具体涉及一种全自动离心微流控芯片及其制备方法。

背景技术：

1、从临床的角度来看，从全血中分离和提取单个核细胞进行计数与分析具有重要意义，常用于评估如某些癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病等一系列临床疾病。传统用于全血提取单个核细胞的方法是密度梯度离心，其步骤包括密度梯度液及全血顺序加载、离心分层、血浆移除和目标细胞层提取，这种方法所需样本量大(一毫升到数十毫升)、操作繁琐且过于依赖于人工。即使经过培训的人员也需要仔细观察密度层并准确地提取所需的细胞层，但仍不可避免地造成细胞层紊乱及单个核细胞提取损失。用于单个核细胞分离的离心机，必须在样本完成分层后以最小振动完成减速(刹车)操作。离心机经过优化的加速和减速坡道配合为密度梯度离心特殊设计的离心管可以获得至多88％的单个核细胞分离效率。样本量越大，离心分层所需的离心力就越大，完成分层的时间就越长，减速停止的过程中细胞层越容易受到干扰；另外，使用较小的样本对于样本采集用户更易接受，特别对于受检人数多、工作量大的检测，更需要一种简单、快速、准确的测定方法。因此，使用较少的血液样本获得外周血单个核细胞层和自动化提取是必要的。

2、离心微流控利用一套完整的流体单元操作，例如液体运输、计量、混合和阀门就能实现整个芯片的功能。由于离心芯片中的流体控制由旋转电机完成，成本低、可控，尤其不需要气动接口，具有集成化、自动化、小型化以及多通道等明显的优势。目前针对单个核细胞提取的离心式芯片一般采用虹吸阀或者离心-气动方案完成细胞分层之后的收集工作。传统的虹吸阀依赖于聚合物材料的亲水性改性，但是这些表面改性方法效果持续时间短且不稳定；离心-气动方案则利用高速离心时密封腔体内气体被压缩，转速降低时压力突破离心力完成虹吸，气动泵送会使细胞层紊乱造成细胞提取效率降低，另外这种方法在实际使用中不稳定甚至有些仍然依赖于芯片表面亲水性处理来提高气动泵送效果。总之，目前应用于单个核细胞提取的离心式芯片在完成细胞分层后都需要减速或者停止以打开截止阀门来进行细胞层提取，不可避免地会对细胞层的稳定造成一定影响，因此在保持高速的状态下实现细胞层在线提取是非常必要的，然而现有技术中没有此类方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种全自动离心微流控芯片及其制备方法，该全自动离心微流控芯片采用多通道并行离心式实现了片上密度梯度离心分层和分层后单个核细胞或单个核细胞和粒细胞的自动化提取，大幅降低了样本的最小用量，同时实现了高纯度和高回收率单个核细胞分离和提取，提高了提取回收率、准确性和使用便捷性。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种全自动离心微流控芯片，包括密度梯度离心单元、虹吸阀触发单元和第一细胞收集单元；

4、所述密度梯度离心单元包括第一percoll腔、直通道、样品腔、时序控制通道和沉降腔，所述第一percoll腔的顶部设有第一进液口和第一通气孔，所述第一percoll腔的底部通过直通道与沉降腔的顶部连通，所述样品腔的顶部设有第二进液口和第二通气孔，所述样品腔的底部通过时序控制通道与沉降腔的顶部连通，所述沉降腔的顶部设有第三通气孔，所述直通道、时序控制通道用于实现percoll及全血样本的顺序释放和加载，密度梯度形成过程在沉降腔内完成；

5、所述虹吸阀触发单元包括第二percoll腔、毛细阀和微通道，所述第二percoll腔的顶部设有第三进液口和第四通气孔，所述第二percoll腔的底部依次通过毛细阀和微通道与沉降腔的中部连通，所述毛细阀在高速时打开从而释放第二percoll腔内的percoll，使得沉降腔液面升高；

6、所述第一细胞收集单元包括第一虹吸阀、第一收集腔和废液腔，所述第一收集腔的顶部与废液腔的顶部连通并通过第一虹吸阀与沉降腔的中部连通，所述第一虹吸阀用于目标细胞层的转移和提取，在所述毛细阀打开释放percoll令沉降腔液面升高时触发开启，所述第一收集腔与废液腔位于同一离心半径，所述第一收集腔用于提取单个核细胞，所述第一收集腔的底部设有第一吸液口，所述废液腔用于存储剩余的percoll及血浆，所述废液腔的顶部设有第五通气孔。

7、在另一方案中，该全自动离心微流控芯片还包括第二细胞收集单元；

8、所述第二细胞收集单元包括第二虹吸阀和第二收集腔，所述第二收集腔的顶部通过第二虹吸阀与沉降腔的下部连通，所述第二虹吸阀用于目标细胞层的转移和提取，在所述毛细阀打开释放percoll令沉降腔液面升高时触发开启，所述第二收集腔用于提取粒细胞，所述第二收集腔的底部设有第二吸液口，所述第二收集腔的顶部设有第六通气孔。

9、其中，所述第一percoll腔与样品腔的容积相同且直通道的宽度大于时序控制通道的宽度。

10、其中，所述时序控制通道的长度为大于30mm。

11、其中，所述第一percoll腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离与样品腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离相等。

12、其中，所述毛细阀的宽度大于微通道的宽度，长度小于其高度。

13、其中，在密度梯度离心时沉降腔内液面到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离大于虹吸阀顶点到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离。

14、其中，所述第二percoll腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离为5-10mm。

15、上述另一方案的全自动离心微流控芯片的制备方法之一，包括以下步骤：

16、步骤一、加工聚合物板材，获得双面光滑的圆盘作为盖片，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口、第二进液口、第三进液口和第一通气孔、第二通气孔、第三通气孔、第四通气孔、第五通气孔、第六通气孔，中心为电机安装孔；

17、步骤二、通过注塑制作聚合物微流控芯片作为基片，所述聚合物微流控芯片包括微流控结构和腔室结构，微流控结构的周围设有粘接筋；

18、步骤三、将步骤一得到的盖片和步骤二得到的基片固定并对准，置于超声波键合设备之下；

19、步骤四、使盖片和基片的粘接筋通过超声键合，获得全自动离心微流控芯片。

20、上述另一方案的全自动离心微流控芯片的制备方法之二，包括以下步骤：

21、步骤一、通过激光雕刻机加工聚合物板材得到第一层圆盘，先通过激光雕刻形成毛细阀上表面结构，再通过激光切割得到若干个通孔，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口、第二进液口、第三进液口和第一通气孔、第二通气孔、第三通气孔、第四通气孔、第五通气孔、第六通气孔，中心为电机安装孔；

22、步骤二、通过激光雕刻机加工双面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第二层圆盘，其上带有通过切穿板材得到的微流控结构，中心为电机安装孔；

23、步骤三、通过激光雕刻机加工下表面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第三层圆盘，其上带有通过切穿板材得到的腔室结构，中心为电机安装孔；

24、步骤四、通过激光雕刻机加工聚合物板材，得到第四层圆盘，先通过激光雕刻形成毛细阀下表面结构，再通过激光切割得到微流控圆盘，圆盘中心为电机安装孔；

25、步骤五、将第二层圆盘粘有压敏胶的下表面与第三层圆盘无压敏胶的一面粘贴；

26、步骤六、将第一层圆盘与第二层圆盘粘有压敏胶的上表面粘贴；

27、步骤七、将第三层圆盘带有压敏胶的一面与第四层圆盘粘贴，完成全自动离心微流控芯片的封装。

28、相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过提高微尺度结构表面张力来提高血细胞分层效率，设计时序控制通道实现芯片上进样顺序的控制与目标细胞层的提取，代替传统密度梯度离心方法中手动操作的繁杂过程，实现全血中目标细胞层的自动分离和提取。另外，针对密度梯度离心静止提取造成细胞层紊乱的问题提出了虹吸阀高速触发方案，即高于离心分层转速时，第二percoll腔内的percoll液突破毛细阀的阻碍进入到沉降腔，腔内液面升高从而越过虹吸阀顶点，单个核细胞进入到第一收集腔内或单个核细胞和粒细胞分别进入到第一收集腔和第二收集腔内。