一种高效广谱的抗冠状病毒多肽的制备方法与流程

本发明属于多肽药物合成，尤其涉及一种多肽的制备方法。

背景技术：

1、病毒主要通过呼吸道飞沫\密切接触飞沫、物-口等途径传播，病毒进入人体之后，在呼吸道迅速的进行相关的复制、繁殖，最终使患者产生呼吸道感染症状。

2、世界卫生组织(who)提出的“关切的变异株”(variant of concern,voc)有5个，分别为阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、伽玛(gamma)、德尔塔(delta)和奥密克戎(omicron)。目前omicron株(尤其ba.5亚分支)感染病例已取代delta株成为全球主要流行株。在全球范围内，各地区、全年龄段人群普遍易感。

3、临床上主要以中药治疗、免疫治疗以及支持性护理治疗为主，基于治疗药物的局限性，还远远无法满足当前的临床需求。具体表现为：

4、①变异株不断涌现，中和抗体失活：中和抗体靶向rbd区域(较易产生突变)，由于对omicron变异株无效，美国fda已修订了罗氏/再生元、礼来的eua情况说明，并撤销了gsk/vir的sotrovimab eua授权。

5、②目前仅有辉瑞的paxlovid、真实生物的阿兹夫定片和腾盛博药的安巴韦单抗/罗米司韦单抗注射液三种新冠特效药获批上市。

6、③药物不良反应多：(1)paxlovid：用药过程中会出现腹泻、味觉倒错、消化不良、胃食管反流病、呕吐、肌痛、头晕等症状；具有肝脏毒性(肝转氨酶升高、有临床表现的肝炎和黄疸)，还有诱导hiv-1耐药的风险。(2)阿兹夫定：用药过程中可能会出现神经系统疾病(头晕、头痛、困倦、嗜睡、记忆受损等不良反应)、肝肾功能异常、胃肠系统疾病(恶心、呕吐、腹泻、腹胀、腹部不适、腹痛、排便频率增加、消化不良等)、血液参数异常、血乳酸升高等不良反应。(3)molnupiravir：用药过程中可能会出现过敏(荨麻疹、中毒性皮疹、红斑)、腹泻、恶心、呕吐、浮动性眩晕、头痛等不良反应。

7、④潜在耐药性：小分子化药产生耐药性只是时间问题，近期有报道，新冠感染患者服用paxlovid后出现多个核酸检测复阳病例。

8、基于上述治疗药物的局限性与未满足的临床需求可知，亟待开发针对目前流行以及未来出现的新的变异毒株的广谱、高效、可及性较高的抗covid-19药物。

9、膜融合是一种极其重要的生物学现象，众多严重危害人类健康的i型包膜病毒都是通过膜融合感染宿主细胞，如hiv、流感病毒、埃博拉病毒、sars-cov、mers-cov以及当前正在流行的sars-cov-2等。

10、人冠状病毒在侵染靶细胞的过程中，其包膜糖蛋白(s蛋白)发挥着关键作用。s蛋白可分为s1亚单位和s2亚单位，s1亚基包含两个功能域，n末端结构域(ntd)和受体结合域(rbd)，均负责病毒与宿主细胞受体(人血管紧张素转换酶2，ace2)的结合。它们还含有几种构象型中和表位，是开发中和抗体和疫苗的靶标。s2亚基包含三个功能域，融合肽(fp)和2个七肽重复序列区(hr)-hr1和hr2。s1中的rbd与受体结合后，s2亚基通过将fp插入宿主细胞膜而改变构象，紧接着hr1形成三聚体螺旋，而hr2则反向折叠于hr1三聚体所形成的沟槽中，导致一个典型的六螺旋束结构(6-hb)，从而拉近病毒膜和细胞膜发生融合反应，使病毒的基因物质通过融合孔进入到靶细胞内复制产生新的病毒颗粒。

11、研究发现，来源于众多病毒hr1和hr2区域的多肽可以作为病毒膜融合抑制剂，其作用机制就是竞争性地与处于融合前状态的融合蛋白结合，从而阻断6-hb结构的形成。目前，作用于病毒膜融合蛋白跨膜亚基、抑制同源6-hb形成的融合抑制剂已上市药物分别为罗氏的恩夫韦肽(t20，2003美国fda批准)和前沿生物的艾博韦泰(2018中国nmpa批准)，用于治疗hiv感染；此外，扶素生物的西夫韦肽、康宝生物的利普韦肽分别处于临床ii期、i期。膜融合抑制剂类抗病毒药物，靶点明确，成药性已经过验证。为改善多肽的半衰期、提高抗病毒活性，基于脂类化合物(如脂肪酸和胆固醇等)修饰的脂肽(lipopeptide)是近年来病毒膜融合抑制剂药物研发的重点方向。

12、ykyy017是一种冠状病毒膜融合抑制剂，作用于sars-cov-2病毒s蛋白s2亚基hr1区，可以竞争性地与病毒hr1区相互作用形成异源六螺旋束结构(6-hb)，从而抑制病毒本身的hr1和hr2结构域之间同源6-hb的形成，阻断病毒与宿主细胞的融合过程，发挥抗病毒活性，且具有广谱性。

13、ykyy017肽序列如seq id no.1所示：

14、ac-ser-val-val-asn-ile-gln-lys-glu-ile-asp-arg-leu-asn-glu-val-ala-lys-asn-leu-asn-glu-ser-leu-ile-asp-leu-gln-glu-leu-gly-lys-tyr-glu-gln-ty r-ile-lys-glu-ala-ala-ala-lys-lys(chol)-nh2

15、其中，乙酰基(ac-)为氨基端保护基团；末端氨基(-nh2)为羧基端保护基团；chol为修饰于c末端氨基酸赖氨酸(lys)上的胆固醇琥珀酸单酯基团。

16、现有专利cn 114736272 a中公开了ykyy017肽的制备方法，仅停留于实验室研究阶段；但是由实验室研究阶段扩展到生产阶段，随着生产规模的扩大，会导致产品的纯度和收率呈现显著的降低趋势。根据多肽领域的制备生产经验来看，实验室研究扩展到生产阶段，其纯度等产品性质能降低约10％～20％。

17、因此，如何提高ykyy017的纯化收率以及产品纯度，并且大规模的生产出高纯度脂肽，实现实验室小批量研究到大规模生产的需求，是目前亟需解决的关键性技术问题。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明提供了一种多肽的制备方法。所述方法通过特定的纯化过程和参数，显著提高了纯化过程的收率(高达9.3％)、纯化产品的纯度(98.63％)以及原料的溶解速率(＜1min)。

2、与此同时，①通过两步纯化，可显著降低杂质含量，提升产品纯度和收率；相较于仅通过一步纯化制得的产品纯度提高25％以上，最大单杂含量降低了1.75％；制剂产品的纯度提升显著；②通过三步纯化过程，制备得到的产品纯度(98.63％)最优，杂质最少(低至0.32％)，并且收率(8.9％)显著；③两步纯化过程中，选用特定的苯己基作为色谱柱填料，以及④三步纯化过程中，选用特定的c18作为色谱柱填料，制备出的产品纯度高(高达98.63％)、杂质少(低至0.32％)、分离效果优异(拖尾因子低至1.220)、纯化效率高(理论塔板数高达17442)；⑤流份上样前采用冰醋酸作为稀释剂进行稀释，获得具有高溶解度的制剂原料(＜1min)；⑥所述方法适用于大规模生产阶段，得到高纯度、高收率的制剂产品。具体如下：

3、一种多肽的制备方法，其中，

4、1)合成：采用固相合成方法制备多肽；

5、2)纯化：将多肽的溶液采用柱色谱进行纯化并，收集流份；

6、所述流份或其并样或并样混合物进入下一纯化过程或循环本次纯化过程；

7、所述纯化过程包括一步纯化和二步纯化。

8、在一些实施方案中，所述一步纯化和二步纯化的制备柱色谱填料种类为苯己基填料。

9、在一些优选的实施方案中，所述循环本次纯化过程的流份、其并样或并样混合物，上样前，添加冰醋酸稀释。

10、在一些更优选的实施方案中，所述冰醋酸的添加量为原流份体积的5～15％。

11、在一些优选的实施方案中，所述一步纯化中，对符合第1.1标准的流份进行收集；

12、表1

13、

14、在一些优选的实施方案中，对剩余流份或其并样进行循环一步纯化过程。

15、在一些优选的实施方案中，剩余流份选自符合第1.2标准的流份和/或符合第1.3标准的流份；

16、表2

17、

18、在一些优选的实施方案中，将符合第1.1标准的流份合并为第1.1标准并样。在一些实施方案中，符合第1.1标准的流份为第1流份；将符合第1.1标准的流份合并为第1并样。

19、在一些优选的实施方案中，将符合第1.2标准的流份合并为第1.2标准并样。在一些实施方案中，符合第1.2标准的流份为第2流份；将符合第1.2标准的流份合并为第2并样。

20、在一些优选的实施方案中，将符合第1.3标准的流份合并为第1.3标准并样。在一些实施方案中，符合第1.3标准的流份为第3流份；将符合第1.3标准的流份合并为第3并样。

21、在一些优选的实施方案中，将第1.2标准并样和第1.3标准并样合并为第1标准剩余流份并样混合物。在一些实施方案中，第2并样和第3并样可以混合成为第2并样和第3并样的混合物。

22、在一些优选的实施方案中，一步纯化包括以下步骤：

23、i)洗柱：采用一步纯化洗脱流动相对制备色谱柱进行洗柱；

24、ii)上样前平衡：采用一步纯化起始流动相进行制备上样前平衡；

25、iii)上样：将肽溶液进行上样

26、iv)顶样：上样结束，用5-30％乙腈溶液，将样品带入制备色谱柱中；顶样时长约2-10min；

27、v)洗脱：采用一步纯化流动相梯度进行洗脱；

28、vi)检测及流份的收集：将洗脱后的样品利用液相色谱法进行检测，收集第1流份、第2流份和/或第3流份，第1流份备后续进行二步纯化使用；第2流份和第3流份备后续循环一步纯化使用；

29、vii)除第1流份外，对剩余流份或其并样或并样混合物循环纯化：重新返回一步纯化过程，重复进行步骤i)～vi)，收集第1流份；其中，将步骤iii)中的肽溶液替换为剩余流份或其并样或并样混合物进行上样，上样前补加10％剩余流份或其并样或并样混合物体积的冰醋酸进行稀释；所述剩余流份或其并样或并样混合物选自第2流份或其并样、第3流份或其并样以及第2流份和第3流份的并样混合物；

30、优选地，步骤vii)剩余流份或其并样或并样混合物循环纯化的次数为1～3次，优选为1次；

31、viii)将步骤vi)收集的第1流份和步骤vii)收集的第1流份合并，获得第1并样。

32、在一些优选的实施方案中，所述二步纯化中，对符合第1.1标准的流份或第1.1标准并样采用柱色谱进行纯化，对符合第2.1标准的流份进行收集，剩余流份循环二步纯化过程；

33、表3

34、

35、在一些优选的实施方案中，对剩余流份或其并样进行循环二步纯化过程；

36、在一些优选的实施方案中，剩余流份选自符合第2.2标准的流份和/或符合第2.3标准的流份；

37、表4

38、 标准 主峰前/主峰后的流份要求 第2.2标准 主峰前的流份满足主峰纯度≥85.0％ 第2.3标准 主峰后的流份满足主峰纯度≥75.0％

39、。

40、在一些优选的实施方案中，将符合第2.1标准的流份合并为第2.1标准并样。在一些实施方案中，将符合第2.1标准的流份或第2.1标准并样作为成品。在一些实施方案中，符合第2.1标准的流份为第4流份；将符合第2.1标准的流份合并为第4并样。

41、在一些优选的实施方案中，将符合第2.2标准的流份合并为第2.2标准并样。在一些实施方案中，符合第2.2标准的流份为第5流份；将符合第2.2标准的流份合并为第5并样。

42、在一些优选的实施方案中，将符合第2.3标准的流份合并为第2.3标准并样。在一些实施方案中，符合第2.3标准的流份为第6流份；将符合第2.3标准的流份合并为第6并样。

43、在一些优选的实施方案中，将第2.2标准并样和第2.3标准并样合并为第2标准剩余流份并样混合物。在一些实施方案中，第5并样和第6并样可以混合成为第5并样和第6并样的混合物。

44、在一些优选的实施方案中，二步纯化包括以下步骤：

45、i)洗柱：采用二步纯化洗脱流动相对制备色谱柱进行洗柱；

46、ii)上样前平衡：采用二步纯化起始流动相进行制备上样前平衡；

47、iii)上样：将第1流份或其并样进行上样；

48、iv)顶样：上样结束，用5-30％乙腈溶液，将样品带入制备色谱柱中；顶样时长约2-10min；

49、v)洗脱：采用二步纯化流动相梯度进行洗脱；

50、vi)检测及流份的收集：将洗脱后的样品利用液相色谱法进行检测，收集第4流份、第5流份和/或第6流份；

51、vii)除第4流份外，对剩余流或其并样或并样混合物循环纯化：重新返回二步纯化过程，重复进行步骤i)～vi)，收集第4流份；其中，将步骤iii)中的第4流份或其并样替换为剩余流份或其并样或并样混合物进行上样，上样前补加10％剩余流份或其并样或并样混合物体积的冰醋酸进行稀释；所述剩余流份或其并样或并样混合物选自第5流份或其并样、第6流份或其并样以及第5流份和第6流份的并样混合物；

52、优选地，步骤vii)剩余流份或其并样或并样混合物循环纯化的次数为1～3次，优选为1次；

53、viii)将步骤vi)收集的第4流份和步骤vii)收集的第4流份合并，获得第4并样。

54、在一些优选的实施方案中，所述纯化过程还包括三步纯化。

55、在一些更优选的实施方案中，所述三步纯化的制备柱色谱填料种类为c18填料。

56、在一些优选的实施方案中，所述三步纯化中，对符合第2.1标准的流份或第2.1标准并样采用柱色谱进行纯化，对符合第3.1标准的流份进行收集；

57、表5

58、

59、在一些优选的实施方案中，对剩余流份或其并样进行循环三步纯化过程；

60、在一些优选的实施方案中，剩余流份选自符合第3.2标准的流份和/或符合3.3标准的流份；

61、表6

62、 标准 主峰前/主峰后的流份要求 第3.2标准 主峰前的流份满足主峰纯度≥85.0％ 第3.3标准 主峰后的流份满足主峰纯度≥85.0％

63、。

64、在一些优选的实施方案中，将符合第3.1标准的流份合并为第3.1标准并样。在一些实施方案中，将符合第3.1标准的流份或第3.1标准并样作为成品。在一些实施方案中，符合第3.1标准的流份为第7流份；将符合第3.1标准的流份合并为第7并样。

65、在一些优选的实施方案中，将符合第3.2标准的流份合并为第3.2标准并样。在一些实施方案中，符合第3.2标准的流份为第8流份；将符合第3.2标准的流份合并为第8并样。

66、在一些优选的实施方案中，将符合第3.3标准的流份合并为第3.3标准并样。在一些实施方案中，符合第3.3标准的流份为第9流份；将符合第3.3标准的流份合并为第9并样。

67、在一些优选的实施方案中，将第3.2标准并样和第3.3标准并样合并为第3标准剩余流份并样混合物。在一些实施方案中，第8并样和第9并样可以混合成为第8并样和第9并样的混合物。

68、在一些优选的实施方案中，三步纯化包括以下步骤：

69、i)洗柱：采用三步纯化洗脱流动相对制备色谱柱进行洗柱；

70、ii)上样前平衡：采用三步纯化起始流动相进行制备上样前平衡；

71、iii)上样：将第4流份或其并样进行上样；

72、iv)顶样：上样结束，用5-30％乙腈溶液，将样品带入制备色谱柱中；顶样时长约2-10min；

73、v)洗脱：采用三步纯化流动相梯度进行洗脱；

74、vi)检测及流份的收集：将洗脱后的样品利用液相色谱法进行检测，收集第7流份、第8流份和/或第9流份；

75、vii)除第7流份外，对剩余流或其并样或并样混合物循环纯化：重新返回三步纯化过程，重复进行步骤i)～vi)，收集第7流份；其中，将步骤iii)中的第4流份或其并样替换为剩余流份或其并样或并样混合物进行上样，上样前补加0.5-2倍剩余流份体积的水进行稀释，优选补加1倍剩余流份体积的纯化水；所述剩余流份或其并样或并样混合物选自第8流份或其并样、第9流份或其并样以及第8流份和第9流份的并样混合物；

76、优选地，步骤vii)剩余流份或其并样或并样混合物循环纯化的次数为1～3次，优选为1次；

77、viii)将步骤vi)收集的第7流份和步骤vii)收集的第7流份合并，获得第7并样。

78、在一些优选的实施方案中，所述一步纯化洗脱流动相为：流动相a1：0.05％～0.3％的tfa水溶液，优选0.1％的tfa水溶液；流动相b：乙腈。

79、在一些优选的实施方案中，所述二步纯化洗脱流动相为：流动相a2：2mm～20mm碳酸氢铵溶液，优选10mm碳酸氢铵溶液；流动相b：乙腈。

80、在一些优选的实施方案中，所述三步纯化洗脱流动相为：流动相a3：0.5wt％～5wt％醋酸溶液，优选2wt％醋酸溶液；流动相b：乙腈。

81、在一些优选的实施方案中，还包括将完成纯化后的样品进行冻干，得到冻干粉。

82、在一些实施方案中，所述多肽包括20～60个氨基酸。

83、在一些优选的实施方案中，所述多肽用于治疗新型冠状病毒。

84、在一些更优选的实施方案中，所述多肽包括ykyy017，所述ykyy017的多肽序列为：

85、ac-ser-val-val-asn-ile-gln-lys-glu-ile-asp-arg-leu-asn-glu-val-ala-lys-asn-leu-asn-glu-ser-leu-ile-asp-leu-gln-glu-leu-gly-lys-tyr-glu-gln-ty r-ile-lys-glu-ala-ala-ala-lys-lys(chol)-nh2。

86、在一些优选的实施方案中，所述多肽的合成方法如下：

87、a)选用从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护多肽；优选采用rink amide-mbha resin；

88、b)选择性脱除lys的侧链保护基；优选采用肼作为催化剂，选择性脱除lys的侧链保护基；

89、c)在偶联剂存在条件下偶联侧链胆固醇琥珀酸单酯；

90、d)在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到所述多肽。

91、在不考虑损失的情况下，可以不对剩余流份或其并样或并样混合物进行循环纯化。例如，在将肽粗品进行一步纯化后，获得第1流份；将第1流份进行二步纯化，获得第4流份；将第4流份进行三步纯化，获得第7流份。

92、剩余流份可以单独进行一步、二步或三步纯化，也可以在合并后再进行一步、二步或三步纯化。

93、此外，如果为非连续实验，时间间隔超过24h，实验中的中间产品有储存需求，则将收集流份或并样及时补加1倍体积的纯化水于2～8℃冷库存储≤3天(室温存储≤1h)。若实验在24h内完成，则中间产品无需储存。

94、与此同时，作为产品的流份或并样，储存时，也应及时补加1倍体积的纯化水于2～8℃冷库存储≤3天(室温存储≤1h)。

95、本发明的有益效果如下：

96、1、二步纯化步骤

97、纯化过程中，采用两个步骤的纯化过程(例如，一步纯化+二步纯化)，能制备出收率和纯度高、分离效果良好、纯化效率高的多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)产品，具体表现为：

98、纯化产品的收率高达9.3％，纯度为97.55％，相邻前杂、相邻后杂、最大单杂中，各杂质含量均控制在0.56％以内；相较于仅通过一步纯化制得的产品纯度提高25％以上，最大单杂含量降低了1.75％；制剂产品的纯度提升显著；

99、拖尾因子控制在1.274，显著低于限定标准≤2.0，分离效果显著；

100、纯化过程中理论塔板数高达16840，显著高于限定标准≥5000，纯化效率高；

101、溶解度显著提升，多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)溶解于甲醇中，溶解时间＜3min，溶解度优异。

102、2、三步纯化步骤

103、采用三个步骤的纯化过程(例如，一步纯化+二步纯化+三步纯化)，制备的多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)产品收率和纯度最优、分离效果最好、纯化效率最高，具体表现为：

104、纯化产品的收率高达8.9％，纯度为98.63％，相邻前杂含量低至0.32％，显著优于限度标准≤1.0；相较于一步纯化+二步纯化方法制得的产品纯度提高了1.08％，相邻前杂含量降低了0.15％，相邻后杂含量降低了0.12％；制剂产品的纯度提升显著；

105、拖尾因子仅1.220，显著低于限定标准≤2.0，分离效果最优；

106、纯化过程中理论塔板数高达17442，显著高于限定标准≥5000，纯化效率最高；

107、溶解度最优，多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)在甲醇中溶解时间控制在＜1min，相较于二步纯化，溶解度降低为1/3，降低效果显著。

108、3、一步纯化和二步纯化的柱色谱填料

109、a)一步纯化和二步纯化过程中，相较于其他制备填料种类(例如，c8或c18)，采用苯己基作为制备色谱的填料，制备出的多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)产品纯度高、杂质少、分离效果优异、纯化效率高，具体表现为：

110、经过纯化后，产品纯度提升至97％以上，显著高于纯度限度标准；

111、相邻前杂、相邻后杂以及最大单杂中，各杂质含量控制在0.47～0.56％以内，显著低于杂质含量限度标准≤1.0％；

112、拖尾因子控制在1.274，显著低于限定标准≤2.0，分离效果显著；

113、纯化过程中理论塔板数高达16840，纯化效率高。

114、b)反之，当采用其他制备柱色谱的填料种类(例如，c8或c18)，纯化得到的产品，纯度低，杂质含量高、分离效果差、纯化效率低；因此，无法作为纯化多肽(例如，新冠多肽ykyy017)过程中的合格填料使用，具体表现为：

115、纯化后的产品，主峰纯度仅为60～90％，无法达到纯度标准≥97.0％，无法纯化出合格的制剂产品；

116、各杂质含量显著升高，相邻前杂、相邻后杂以及最大单杂约高达1～11％，显著高于杂质含量标准≤1.0％，纯化产品的杂质含量不合格；

117、拖尾因子增大，增大至1.435～3.412，分离效果差；

118、纯化过程中理论塔板数降低明显，柱效率降低，进而使纯化效率降低显著。

119、4、三步纯化的柱色谱填料

120、a)三步纯化过程中，相较于其他制备填料的种类(例如，c8或苯己基)，采用c18作为制备色谱的填料，制备出的多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)纯度最优、杂质最少、纯化效率最高，具体表现为：

121、纯化产品的纯度为98.63％，相邻前杂含量低至0.32％，显著优于限度标准≤1.0；

122、拖尾因子仅1.220，显著低于限定标准≤2.0，分离效果最优；

123、纯化过程中理论塔板数高达17442，显著高于限定标准≥5000，纯化效率最高；

124、b)反之，采用其他种类制备填料(例如，c8或苯己基)，纯化得到的产品纯度差，无法作为合格的制剂产品；并且存在纯化效率低，甚至造成死吸附无法完成纯化的现象，具体表现为：

125、主峰纯度降低至90.82％，无法达到纯度限度标准(≥97.0％)，因此，无法纯化出合格的制剂产品；

126、相邻后杂以及最大单杂的杂质含量均升高至1.53％，显著高于杂质含量限度标准(≤1.0％)，无法纯化出合格的制剂产品；

127、纯化过程中理论塔板数为9175，纯化效率显著降低；

128、采用其他制备填料，样品易造成死吸附而无法洗出，得不到纯化产品。

129、5、稀释剂种类

130、a)流份进行循环纯化上样前，采用冰醋酸进行稀释，二步纯化得到的产品，溶解度良好，具体表现为：

131、多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)在甲醇中的溶解时间控制在＜3min，溶解度优异；

132、b)流份进行循环纯化上样前，采用冰醋酸和水进行稀释(一步和二步采用冰醋酸稀释，三步采用水稀释)，三步纯化得到的制剂产品，较二步纯化，其溶解度进一步提高，具体表现：

133、多肽(例如，抗新冠多肽ykyy017)在甲醇中的溶解时间控制在＜1min，溶解度最好；

134、c)反之，采用其他种类的物质作为稀释剂(例如，甲醇、乙腈)，终产品溶解度显著降低，具体表现为：

135、相同条件下，采用其他种类的溶剂作为稀释剂，溶解时间显著提高至6～9min以上，溶解时间大幅延长，产品的溶解度差。

136、6、稀释剂用量

137、在流份进行循环纯化过程前，采用5～15％原体积(即原流份或原并样体积)的冰醋酸进行稀释，二步纯化过程中，纯化得到的产品在甲醇溶剂中的溶解时间控制在＜3min，溶解度优异。

138、三步纯化过程中，纯化得到的产品在甲醇溶剂中的溶解时间控制在＜1min，溶解度最好。

139、7、应用

140、本发明所述的制备方法，适用于大规模生产阶段，并且制备得到的产品纯度、收率高，杂质含量少。