基于MALDI-TOF质谱检测技术检测禽流感和新城疫病毒的引物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及动物检疫领域。更具体地，涉及基于maldi-tof质谱检测技术检测禽流感和新城疫病毒的引物组合物及其应用。

背景技术：

1、禽流感及新城疫是危害世界养禽业最严重的两种病毒性传染病，这两种禽病发病快，死亡率高，常常给养禽业造成毁灭性打击。对于禽流感，目前最为严重的是由h5、h7亚型病毒引起的高致病性禽流感和h9亚型病毒引起的禽流感，尽管h9亚型禽流感为低致病性的，但会导致蛋鸡产蛋量大幅下降，肉仔鸡发病率、死亡率升高，对禽养殖效益影响巨大。新城疫目前仍然是危害养禽业最严重且是发病率高的疾病之一，在养殖业的多年发展过程中，尽管采取了密集免疫措施，但也不时发生疫情。

2、禽流感病毒和新城疫病毒均为rna病毒，变异迅速，特别是禽流感病毒ha基因和新城疫f基因，在免疫选择压力下，亚型内或同一基因型毒株基因序列可存在较大差异。因此，针对单一基因靶位的分型检测技术常常会漏检同一亚型的变异毒株。

3、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(maldi-tof)是一种新型质谱检测技术，通过将生物大分子与芯片上基质分子共结晶后，在激光轰击后与基质分离形成带正电的离子，在真空飞行中将不同质核比的离子分开并进行检测。该方法通过与超微量多重(rt-pcr)联用，设计针对不同靶标的一系列延伸引物(uep)进行单碱基延伸反应，通过对多种特异性延伸片段进行质量检测，从而实现对样品的多靶标同步检测。目前，核酸飞行质谱可实现最多单管40个靶点的同步检测，可显著降低单个靶点检测的时间和物料成本。禽流感病毒主要亚型和新城疫中强毒株变异大，多靶点检测思路可快速对禽流感病毒主要亚型和中强毒力新城疫病毒株作出精准鉴别。由于禽流感病毒h5/h7/h9亚型以及中强毒力新城疫病毒株型复杂，目前尚未有快速、灵敏的针对以上病毒毒株的多靶点分子检测技术。

4、因此，需要提供一种灵敏、特异的能同时对禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型进行多靶标检测的方法，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于maldi-tof质谱检测技术检测禽流感和新城疫病毒的引物组合物或试剂盒，及利用上述引物组合物或试剂盒检测禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型的方法，该方法不仅灵敏、特异，而且能实现多靶标同步检测；不仅适用于禽类咽喉/泄殖腔拭子以及组织脏器中禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型的快速检测分型，也可用于禽类养殖企业样品中禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型的快速筛查。

2、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

3、本发明首先提供了一种基于maldi-tof质谱检测技术检测禽流感和新城疫病毒的引物组合物，包括对禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型检测的扩增引物组及uep延伸引物组；所述扩增引物组包括：

4、用于通用检测禽流感病毒的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、用于检测禽流感病毒h5亚型的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq idno.3和seq id no.4所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示；

6、用于检测禽流感病毒h7亚型的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq idno.7所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；

7、用于检测禽流感病毒h9亚型的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq idno.9所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；

8、用于通用检测新城疫病毒的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；

9、用于检测新城疫病毒中强毒株的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq idno.13所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；

10、用于检测内参基因β-actin的扩增引物，其上游引物的核苷酸序列如seq idno.15所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示。

11、进一步，所述uep延伸引物组包括：

12、用于通用检测禽流感病毒的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.17所示；

13、用于检测禽流感病毒h5亚型的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.18～seqid no.20所示；

14、用于检测禽流感病毒h7亚型的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.21所示；

15、用于检测禽流感病毒h9亚型的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.22～seqid no.23所示；

16、用于通用检测新城疫病毒的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.24所示；

17、用于检测新城疫病毒中强毒株的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.25～seq id no.28所示；

18、用于检测内参基因β-actin的uep延伸引物，其核苷酸序列如seq idno.29～seqid no.31所示。

19、本发明进一步公开了基于maldi-tof质谱检测技术检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组合物。

20、进一步，所述试剂盒还包括完成多重rt-pcr扩增反应、sap反应、单碱基延伸反应和飞行质谱检测所需的其他试剂。这些试剂本领域技术人员可以根据需要进行购买或按照文献的方法进行配制。例如，所述试剂盒还包括2×hu mp缓冲液，包含耐热反转录酶、taq酶以及防污染udg酶的酶混合物，sap缓冲液，sap酶dntps，iplex缓冲液，iplex终止mix，iplex酶，depc水，阴性对照，阳性对照中的部分或全部。

21、进一步，所述阴性对照为鸡肉组织样品，用0.01mol/l ph7.2 pbs缓冲盐水制成5％悬液。

22、进一步，所述阳性对照为含有目的扩增基因的体外转录rna(ivt rna)；具体为包含禽流感病毒a/duck/lcr/2001(h5n1)m基因完整编码区(1027bp)、ha基因完整编码区(1743bp)，a/chicken/strc/2002(h7n1)ha基因完整编码区(1683bp)，a/chicken/sd/2002(h9n2)ha基因完整编码区(1683bp)，新城疫病毒lasota株m基因完整编码区(1276bp)以及f48e9株f基因完整编码区(1975bp)的体外转录rna稀释至104copies/μl作为阳性对照。

23、本发明进一步还提供了一种基于maldi-tof质谱检测技术检测禽流感和新城疫病毒的方法，所述方法包括如下步骤：

24、提取待测样品中的rna；

25、以提取的rna为模板，利用上述引物组合物或试剂盒中的扩增引物组进行一步法多重rt-pcr扩增反应；

26、sap反应去除dntp；

27、使用上述uep延伸引物组进行单碱基延伸反应；

28、飞行质谱检测。

29、进一步，所述一步法多重pcr扩增反应的反应体系为5μl体系，包括2×hu mp缓冲液2.5μl，扩增引物混合物0.1μl，酶混合物0.3μl，depc水0.1μl和模板2μl；反应条件为：50℃/10min，95℃/5min；95℃/15s，55℃/5s，60℃/30s，45个循环。

30、进一步，所述扩增引物混合物是将seq id no.1-16所示的引物均稀释至100μmol/l，其中，seq id no.7和seq id no.8所示的引物各取8μl，其余14条引物各取5μl，混合后定容至100μl。

31、进一步，所述sap反应体系为2μl/扩增反应，直接加入一步法多重rt-pcr扩增反应完成的多重pcr产物中，包括sap缓冲液0.17μl，sap酶0.3μl和depc水1.53μl；反应条件为：37℃/40min，85℃/5min。

32、进一步，所述单碱基延伸反应体系为2μl/扩增反应，直接加入上述sap反应完成的体系中，包括iplex缓冲液0.2μl，iplex终止mix 0.2μl，uep延伸引物混合物0.94μl，iplex酶0.04μl和depc水0.62μl；反应条件为：预变性94℃/30s；94℃/5s，52℃/5s，80℃/5s，40个循环，其中每个循环中，94℃/5s后，52℃/5s与80℃/5s连续循环5次；72℃/3min。

33、进一步，所述uep延伸引物混合物按照下表进行配制，具体所述uep延伸引物混合物的总体积为100μl，各引物的加入量为核苷酸序列如seq idno.17、seq id no.18、seq idno.20、seq id no.24所示的引物各2μl，核苷酸序列如seq id no.19、seq id no.25、seqid no.26所示的引物各3μl，核苷酸序列如seq id no.21所示的引物10μl，核苷酸序列如seq id no.22所示的引物1.2μl，核苷酸序列如seq id no.23所示的引物3.2μl，核苷酸序列如seq id no.27、seq id no.29所示的引物各9μl，核苷酸序列如seq idno.28所示的引物4μl，核苷酸序列如seq id no.30、seq id no.31所示的引物各4.5μl。

34、

35、

36、进一步，所述方法进一步包括检测后根据已知uep延伸引物是否发生延伸并出现特异延伸峰和碱基进行结果判定；每种靶标的质谱分析结果中对应有uep延伸引物和延伸产物两个峰位置，若引物延伸转化率100％，则uep延伸引物峰消失，若某靶标任一延伸产物所对应的分子量位置处出现单峰且信噪比(snr)>6，则判为该靶标阳性；否则，判为阴性。

37、进一步，所述uep延伸引物的分子量与延伸产物的分子量如表1所示。

38、本发明的有益效果如下：

39、本发明针对禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型，设计多重rt-pcr引物及uep延伸引物，建立并优化对样品中禽流感或新城疫病毒主要亚型或株型进行同步检测的maldi-tof质谱检测方法，取得了优异的技术效果：1)高时效性：该方法兼具pcr、芯片与质谱三大技术优势，可以同步检测十几个以上基因位点，特别适用于禽流感新城疫病毒亚型、株型多且复杂的特点；2)性价比高：引物不需要特殊修饰，也不需要高级别技术手段纯化，page纯引物即可满足需求；3)特异性强：扩增引物和uep延伸引物分别针对靶序列的3个不同区域，且可以测定uep延伸引物3’相邻snp位点，特异性更强。

40、本发明maldi-tof质谱检测方法不仅适用于进出口禽类咽喉/泄殖腔拭子以及组织脏器中禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型的快速检测分型，也可用于禽类养殖企业样品中禽流感及新城疫病毒主要亚型或株型的快速筛查。