一种编码黑松富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶的cDNA序列及其氨基酸序列与应用

：本发明属于基因工程，涉及一种黑松幼苗抗松材线虫病相关的基因的克隆和功能验证，尤其是涉及一种编码黑松富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(leucine-rich-repeat receptor like kinases,lrr-rlks,lrk)的cdna序列及其氨基酸序列与应用。

背景技术

0、
背景技术：

1、松材线虫病(bursaphelenchus xylophilus)是一种世界性的重大检疫性森林病害。松材线虫病在亚洲感染松树后病害发展速度快，危害大，防治难，造成严重的经济损失。松材线虫病在自然情况下可以感染的松属树种有51个，非松属树种16个。

2、富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(leucine-rich-repeat receptor likekinases,lrr-rlks,lrk)是植物中检测到的最大的一类跨膜类受体激酶，包含胞外结构域、单次跨膜域和胞内激酶域，可通过胞外结构域结合病原菌、激素信号与胁迫相关的外界信号分子，激活胞内激酶域的磷酸化/去磷酸化的活性，完成信号的跨膜运输，进而调控植株的生长发育、参与激素信号途径和对外界胁迫的应答过程。在拟南芥中亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶的生物合成途径已经有完整的说明，但是在黑松中，对lrk基因尚未有克隆研究。因此，研究黑松抗松材线虫病过程中涉及的关键酶的基因，并对其进行克隆及功能研究，有助于了解黑松抗松材线虫胁迫的响应机制及其分子水平的调控，对于黑松的基因工程育种、松材线虫病防治以及检测判断黑松植株是否感染松材线虫病具有重要的意义。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种黑松幼苗抗松材线虫病相关的基因(pthlrk1)序列与应用，尤其是一种编码黑松富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(lrk)的cdna序列及其氨基酸序列与应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供一种编码黑松富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(lrk)的cdna序列及其氨基酸序列，按照以下方法操作：

3、一、黑松pthlrk1基因的cdna部分序列的克隆

4、参照trizol提取试剂盒(b511321，生工生物工程(上海)股份有限公司)的说明书提取黑松总rna，取0.5-2μg总rna为模板，利用第一链cdna合成试剂盒(b532435，生工生物工程(上海)股份有限公司)合成cdna第一链，冻存于-20℃备用。

5、根据已知的黑松近缘物种海岸松的lrk序列资料及黑松转录组测序数据，设计三对引物分别进行pcr扩增，三对引物如下：

6、y1'-f：5′-gaaccgaactgcagaaaacaatat-3′；

7、y1'-r：5′-aacttggttttgatagcctccag-3′。

8、y2'f：5′-agatccttttccgtgagaataaatg-3′；

9、y2'r：5′-ttagtttggaatgatgtgcattagg-3′。

10、y3f：5′-ccgtcaaattgctctcacagttc-3′；

11、y3r：5′-cccaagatttgacgagatggttac-3′。

12、以cdna第一链为模板，进行pcr扩增，反应体系如下：引物f(10μm)0.5μl，引物r(10μm)0.5μl，dntp(10mm)0.2μl，cdna第一链模板1μl，taq酶(5u/μl)0.2μl，ddh2o10.1μl。pcr程序：95℃预变性3min，94℃30s，58℃30s，72℃90s，循环33次，72℃延伸10min；得到的pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后(如图1a、b、c)，利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(b518131，生工生物工程(上海)股份有限公司)分别回收目的dna，并分别连接到t-vector上，构建t-pthlrk，将连接pcr产物的载体分别转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆并测序；分别以上述三对引物进行pcr扩增分别获得长度为1017bp、1222bp、1099bp的片段，拼接得到黑松pthlrk1基因cdna序列大片段。

13、二、黑松pthlrk1基因3′端cdna序列克隆

14、3′端cdna序列克隆采用3′-race方法，按照3′-race试剂盒(b605101，生工生物工程(上海)股份有限公司)说明书进行，以适量总rna为模板，以3′adaptor gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgtttttttttttttttttt为引物，在reverse transcriptase mix(rnase h-)逆转录酶的作用下，50℃温育30min，85℃加热1min合成cdna第一链，-20℃保存；根据黑松pthlrk1基因大片段cdna序列设计引物(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，进行两轮pcr。引物序列如下：

15、nf9：5′-tctctttatctgtggattcgactgc-3′；

16、nf10：5′-gaggaatggagtggagtgacaac-3′。

17、5.3′outer：5′-gctgtcaacgatacgctacgtaac-3′；

18、5.3′inner：5′-gctacgtaacggcatgacagtg-3′。

19、以3′adaptor为反转录引物得到的cdna第一链为模板，以两个引物进行两轮pcr扩增，反应体系如下：

20、

21、

22、pcr程序：第一轮为降温pcr：94℃预变性60s，94℃30s，70*1℃(*1表示每个循环降1℃)30s，72℃60s，循环10次；第二轮：94℃30s，60℃30s，72℃60s，循环25次，72℃延伸480s；得到的pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后(如图1d)，利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(b518131，生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的dna，并将其连接到t-vector上，构建t-pthlrk，将连接pcr产物的载体转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆并测序，该序列大小为375bp。

23、三、黑松pthlrk1基因5′端cdna序列克隆

24、5′端cdna序列克隆采用5′-race方法，按照5′-race试剂盒(b605102，上海生工公司产品)说明书进行，以适量总rna为模板，使用5′-race反转录特异性引物(nrt1)，在reverse transcriptase mix(rnase h-)逆转录酶的作用下，50℃温育30min，85℃加热1min，合成cdna第一链，将cdna第一链进行rnase h消化、cdna纯化回收、tdt加c尾处理，-20℃保存。

25、根据黑松pthlrk1基因大片段cdna序列设计克隆5′端cdna序列所需的引物(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，进行两轮pcr。引物序列如下：

26、5′adaptor：gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgggiigggiigggiig。

27、nrt1：5′-gtctcttgacaattcacaggctg-3′。

28、nr1：5′-cagcaatctgccagagctaacc-3′。

29、nr2：5′-tttatctgagaccgctacgtttcc-3′。

30、5.3′outer：5′-gctgtcaacgatacgctacgtaac-3′。

31、以上述tdt加c尾处理过的cdna第一链为模板，以两对引物进行两轮pcr扩增，反应体系如下：

32、

33、

34、pcr程序：第一轮为降温pcr：94℃预变性60s，94℃30s，70*1℃(表示每个循环降1℃)30s，72℃60s，循环10次；第二轮：94℃30s，60℃30s，72℃60s，循环25次，72℃延伸480s；得到的pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后(图1e)，利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(b518131，生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的dna，并将其连接到t-vector上，构建t-pthlrk，将连接pcr产物的载体转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆并测序，该序列大小为404bp。

35、四、黑松pthlrk1基因全长cdna序列测序

36、将上述得到的5个序列(1017bp、1222bp、1099bp、375bp和404bp)进行拼接，推断黑松pthlrk1基因全长cdna序列，共3081bp。利用orf finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对拼接的全长cdna序列进行开放阅读框的查找，黑松pthlrk1基因orf区域共2679bp，位于第78-2756bp处，编码892个氨基酸。通过phyre2程序对黑松pthlrk1基因编码蛋白进行三维结构预测，结果表明，该蛋白具有清晰的α-螺旋，β-折叠以及无规则卷曲。

37、序列1：黑松pthlrk1基因的全长cdna序列

38、taatttctggtcttgtggaaggatttttgagtatcgactgcggagggaaaacgaaccgaactgcagaaaacaatataatgtgggtcactgatgataattatatagacgtgggtcacagaggagagatcggaaacgctagtgcttacggttcttacttgcacaccttgcgagttttcccaaagcctctcaacaagtcttgctatcagttgcctgtggtccctgatgtgccttatctcttaaggttatggtttgaagttggaaattacagtggattcaaacaacttccaagctttgctttctctattgagacagagggtatgttagctatgggaaacgtgacgatctcagactgtgacacaccatgttatgatgaaataatatttgttagttctggcagagtcctgtacatttgcttgatcagaacctcggagtctgatgatcccttcgtctctgctatcgagttgagaacgcttcaacaaggcatgtatggactggctaagccaggaacaatgttgatgctagtatggagatatgatgctggtggaaatattaccattaggtatcctcaagacatgttcgaccggatctgggattacgaattgagagtaacttttggcaatcattatcctgtacagcctgtgaattgtcgagagaccatttcaaccagcaataccacagaacttcctccaagtgctgtgatgcaaacagcggcggttattattgacccggcacgtgcgttcgatgtcggatcgactaatggtcatagattattattgctgttatatgttgcagagatcgagcagctaaatatgtctgaacatagatccttttatgtgacaataaatgatgagaaacggtctgaggccattacttctctgagcgattattctacccgggagctaaaatttatatccaatccaacagatgatttcgattttgccttggtcaacactagggatgcaaccagtgatcccataatgaacgcctttgaggcttacgaaataattgacacccaacc

39、ggcaacatatgcgcaagataacaaagctcttgaggctatcaaaagcaggtttggcgtaa

40、aggattggatttctgatccttgttttttgatccagtggaatggaattgtgtgtgaaagca

41、gcacttaccccataagaatttcggaaattgatttgtcaggaaagaatcttacaggattgg

42、tgcccgacgatattagacagttgacggcattagttaaagtgtcgctttacaataatcattt

43、gatagggcaattgccaaatttgtccagtttaaccatgttggagagattgtatctacaaaa

44、caacaacctgagcggtactcttccgtcctggctatgtgaactgaaaaacctaaaagaat

45、tgaatatagagaataataatttcagcggtgtaatacctgtccaacttctcaatggatcatt

46、gaaatttagttactgtggaaacccctacttacctatgcataaggggaaatgcaccctgca

47、tactacaaataagaataaattgaagattatactcggaataacactaggcggaatattaatc

48、atcgctttagcgctgatagtagctattattatgtatcgcaataaattcgggcgaaaagaac

49、agggtattgacagcagaagaagtggactgggaatggaacctagatcttacttgtaccaa

50、gactactcaatggttaccgtgccaaattcaacaaaatcccgttccttcactctagatgag

51、atgatagcggccacacaaggctttagccaggagatcggacgaggaggttttggagcgg

52、tgtttttaggtaaattgcccgaaggaaaatacatagccgtcaaattgctctcacagttct

53、cccaacaaggggttcaagaattcttgaatgaggttgatcttctttccagaatccatcata

54、agaacttggtatctttactgggatattgtaacgaatcaagagaaattatgcttatctacga

55、ctatatggcagaagggtctttaagggatcatctttctggtcctaacgcacatcattccaa

56、actgacttggagagccagactcaaaataactttagatgcagctcaaggactggaatacc

57、tgcacgttggttgcacccccaaaataattcacagggatatcaagaccgccaacatcttgt

58、tagacagcgatttgaatggaaaactaggcgatttcggtctttccaagatgacaactgat

59、ggggaggctactcatgttaccactgccgtaaaaggaactgcaggatacctggatccaga

60、gtatttcaacactcaaatgttgacggagaagagtgatgtgtacagttttggagtggttt

61、tgctggagatcatatgtggtagacaacccatagatctaaaactacctgcagaagaactg

62、aacatcgttagatgggtgaagccgtatgtagtggagaatgataatcctagcagaatatca

63、gaaatcattgacaagaggttaggtggagattacgacatgacatctatcactagtgttgcc

64、aaagtagcgatgagatgtgttcacgctgaaccgtggtctaggccgaacgtgagcgagat

65、agtggccgagctgaaagaggctatcaaacatgaggatcatcgtgcttctgtttcaatttc

66、agaggaagctggtattcaaagtagcgatttgtcgtcggggccagtctctttatctgtgga

67、ttcgactgcacacggaggaatggagtggagtgacaactccaatatttctcaattgggaa

68、ggtaggttggcacgttgctgatatggattgaagggaagttggccaagaagtcaaaccta

69、caggtactagtgatggcatgatttacaatatgggttgatgtcgtgcatttgacataattgt

70、gtcgcacacatctgaaaaaattggtgaaacttaaactgtaaccatctcgtcaaatcttg

71、gggtggtacgtggatgtatatacacgatcatacattatgctgaaactaatctttattaaata

72、ggtattgtgtattttaaatcttcatatcagttttagaattttccaggttaaaatgtttacaa

73、attaataatttcaaaaaaaaaaaaaaa(seq id no:1)

74、序列2：黑松pthlrk1基因orf编码的氨基酸序列

75、mwvtddnyidvghrgeignasaygsylhtlrvfpkplnkscyqlpvvpdvpyllrlwfevgnysgfkqlpsfafsietegmlamgnvtisdcdtpcydeiifvssgrvlyiclirtsesddpfvsaielrtlqqgmyglakpgtmlmlvwrydaggnitirypqdmfdriwdyelrvtfgnhypvqpvncretistsnttelppsavmqtaaviidparafdvgstnghrlllllyvaeieqlnmsehrsfyvtindekrseaitslsdystrelkfisnptddfdfalvntrdatsdpimnafeayeiidtqpatyaqdnkaleaiksrfgvkdwisdpcfliqwngivcesstypiriseidlsgknltglvpddirqltalvkvslynnhligqlpnlssltmlerlylqnnnlsgtlpswlcelknlkelniennnfsgvipvqllngslkfsycgnpylpmhkgkctlhttnknklkiilgitlggiliialalivaiimyrnkfgrkeqgidsrrsglgmeprsylyqdysmvtvpnstksrsftldemiaatqgfsqeigrggfgavflgklpegkyiavkllsqfsqqgvqeflnevdllsrihhknlvsllgycnesreimliydymaegslrdhlsgpnahhskltwrarlkitldaaqgleylhvgctpkiihrdiktanilldsdlngklgdfglskmttdgeathvttavkgtagyldpeyfntqmlteksdvysfgvvlleiicgrqpidlklpaeelnivrwvkpyvvendnpsriseiidkrlggdydmtsitsvakvamrcvhaepwsrpnvseivaelkeaikhedhrasvsiseeagiqssdlssgpvslsvdstahggmewsdnsnisqlgr(seq id no:2)

76、本发明涉及的黑松pthlrk1基因的全长cdna序列是一个完整的cdna序列，通过快速扩增cdna末端途径(race)从黑松中分离得到并命名为黑松pthlrk1。全长cdna序列为3081bp，含有2679bp的开放阅读框(orf)，编码892个氨基酸，编码蛋白的理论分子量为99.63kda，理论等电点(pi)为5.46。

77、利用signalp-5.0程序(https://services.healthtech.dtu.dk)预测信号肽果表明该蛋白不具有信号肽区域。

78、使用tmhmm-2.0程序(https://services.healthtech.dtu.dk)进行跨膜结构域预测表明，pthlrk1基因编码蛋白在484-507氨基酸处具有一个单次跨膜区(图2a)，由胞外向胞内延伸(图2b)，属于一种跨膜蛋白。

79、在interpro网站上对蛋白的功能结构域进行预测(图3)，结果显示，在2-309氨基酸位置存在一个malctin(malectin-like domain)结构域，是一种内质网上的膜锚定蛋白；在317-472氨基酸位置包含一个lrr(leucine-rich repeat domain)超家族结构域，具有抗病特征；在562-386氨基酸位置存在一个丝氨酸-苏氨酸、酪氨酸蛋白激酶(serine-threonine/tyrosine-protein kinase)催化结构域，与该结构域部分重叠的是位于543-836氨基酸位置与位于560-840氨基酸位置的的蛋白激酶(protein kinase-like domain)超家族。这些结构域和同源超家族组成了pthlrk1蛋白的主要功能结构，共同行使pthlrk1基因的功能。

80、应用blast程序，将黑松pthlrk1基因的核苷酸序列与油松(p.tabuliformis，ki711073.1)、白云杉(picea glauca，bt118800.1)、火炬松(pinus taeda，jq019187.1)、巨云杉(picea sitchensis，bt123520.1)、姬蝴蝶兰(phalaenopsis equestris，xm_020737730.1)、美国山核桃(carya illinoinensis，xm_043109997.1)、莴笋(lactucasativa，xm_023908240.3)、油棕(elaeis guineensis，xm_029268492.1)进行同源性分析，结果发现黑松pthlrk1基因序列与油松(p.tabuliformis，ki711073.1)的核苷酸序列同源性最高，为89.14％。系统进化树分析结果显示(图4)，该基因与油松在同一个分支上，亲缘关系较近，系统进化树结果与核苷酸序列同源性分析结果保持了较高的一致性。

81、predictprotein(https://www.predictprotein.org/)预测蛋白二级结构表明，该蛋白有60.56％的无规则卷曲，25.08％的α-螺旋和14.36％的β-折叠。

82、通过phyre2程序对pthlrk1基因编码蛋白进行三维结构预测，结果表明，该蛋白具有清晰的α-螺旋，β-折叠以及无规则卷曲(图5)。

83、富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(leucine-rich-repeat receptor likekinases,lrr-rlks,lrk)是植物中检测到的最大的一类跨膜类受体激酶，包含胞外结构域、单次跨膜域和胞内激酶域，可通过胞外结构域结合病原菌、激素信号与胁迫相关的外界信号分子，激活胞内激酶域的磷酸化/去磷酸化的活性，完成信号的跨膜运输，进而调控植株的生长发育、参与激素信号途径和对外界胁迫的应答过程。

84、本发明与现有技术相比，本发明通过研究黑松受松材线虫侵染后表达水平发生显著改变的基因，发现pthlrk1基因参与了黑松抗病反应，说明该基因具有抗病性，并成功对该基因进行了克隆；有助于了解黑松抗松材线虫胁迫的响应机制及其分子水平的调控，能够用于黑松的基因工程育种、松材线虫病防治以及检测判断黑松植株是否感染松材线虫病。

85、说明书附图：

86、图1为黑松pthlrk1基因cdna片段克隆电泳图，其中a-c为黑松pthlrk1基因cdna部分序列克隆电泳图，a的引物为y1'-f/r，b的引物为y2'f/r，c的引物为y3f/r；d为3′-race扩增产物电泳图；e为5′-race扩增产物电泳图；m：3000bp dna marker。

87、图2为黑松pthlrk1基因编码蛋白的跨膜结构域预测图，其中a为单次跨膜区；b为由胞外向胞内延伸。

88、图3为黑松pthlrk1基因编码蛋白功能结构域预测图。

89、图4为黑松pthlrk1基因核苷酸序列系统发育树。

90、图5为黑松pthlrk1基因编码蛋白的三维结构图。

91、图6为松材线虫侵染后不同时间黑松pthlrk1基因的表达情况示意图。