一种放线菌达托霉素基因簇原位双报告菌株及应用

本发明属于微生物制药领域，涉及基因簇原位双报告菌株筛选，尤其涉及一种放线菌达托霉素基因簇原位双报告菌株及应用。

背景技术：

1、微生物药物在我国医药行业占有重要组成部分，其中约60％以上抗生素来源于链霉菌生产的活性天然产物或其衍生物。然而我国大部分微生物药物发酵水平低。在全球贸易战加剧的背景下，面对日益增加的药物需求，提高菌种发酵水平、降低生产成本显得尤为重要。

2、链霉菌(streptomyces)属于放线菌科，是一种革兰氏阳性细菌，具有较为复杂的次级代谢调控机制和形态分化过程。链霉菌在次级代谢过程中能产生多种具有活性的天然产物，临床使用的大约三分之二的抗生素来自于放线菌,其中链霉菌占比在75％以上，因此链霉菌具有巨大工业价值和潜在的开发价值。链霉菌次级代谢产物之一的达托霉素是一种新型环脂肽类抗生素,由玫瑰孢链霉菌(streptomyces roseosporus)生产。体外研究表明，达托霉素对多种革兰氏阳性细菌具有杀菌活性，包括耐万古霉素肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等。因此，达托霉素强大的抑菌活性以及较低的抗药性使其在国际市场具有巨大的潜力和价值。然而，现阶段仍然存在发酵水平低、生产成本高等不足。

3、达托霉素的生物合成基因簇及其生物合成途径已经被揭示。作为环脂肽类的天然产物，达托霉素是由非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,nrps)dpta/bc/d催化合成的。在dpta-d基因上游还有两个基因dpte/f，分别编码酰基-coa连接酶(acyl-coa ligase)和酰基载体蛋白(acyl carrier protein,acp)，负责活化脂肪酸前体和作为脂酰基载体，用于后续nrps催化的环脂肽化合物的合成。

4、由于达托霉素的产生对于受多重调控因子的影响，单一的改变某一调控因子并不能快速实现高产，因此建立快速筛选高产菌株的方法并能推广到别的类似菌种高产研究中可加快药物高产菌株的开发步伐。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种放线菌达托霉素基因簇原位双报告菌株，是一种经过紫外诱变的基因簇原位双报告高产菌株xm296，该菌株的分类命名为玫瑰孢链霉菌(streptomyces roseosporus)，已于2023年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.27053，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2、该双报告菌株是以玫瑰孢链霉菌δpksⅱδrppaδmelc敲除株为出发菌株，在dpta基因前插入idgs-sfp报告基因、在dptd基因后插入neo报告基因再进行紫外诱变筛选出来的达托霉素高产菌株，其达托霉素产量较出发菌株提高了6.44倍。

3、为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

4、本发明的第一个方面在于提供一种双报告菌株，为出发菌玫瑰孢链霉菌l30(streptomyces roseosporus)δpksⅱδrppaδmelc敲除株的dpta基因前插入idgs-sfp报告基因、在dptd基因后插入neo报告基因的经过诱变的双报告高产菌株，neo的氨基酸序列如seq id no.14所示，idgs-sfp的氨基酸序列如seq id no.16和17所示。

5、就本发明的上述目的，所述双报告基因插入的出发菌株命名为玫瑰孢链霉菌(streptomyces roseosporus)l30,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.15745，保藏日期为2018年5月9日。

6、本发明提供的上述双报告菌株的构建方法，包括：在δpksⅱδrppaδmelc敲除株合成基因簇的dpta前、dptd后分别原位插入显色报告基因idgs(indigoidine合成酶基因)和kanamycin抗性报告基因(neo)，进而在基因簇原位构建了neo-idgs双报告系统菌株，随后对双报告菌株进行随机紫外诱变并通过靛蓝色素测定和卡那霉素抗性浓度测定快速筛选到高产报告菌株。

7、本发明的第二个目的是提供上述双报告菌株在玫瑰孢链霉菌达托霉素高产菌株筛选中应用。所述应用包括：确定双报告菌株的km抗性为50μg/ml，将双报告菌株进行随机紫外诱变处理并将诱变后的孢子液涂布于km抗性为50μg/ml的ymg培养基上，首先确定致死率曲线，当紫外照射时间为5min时，致死率达到90％以上，再挑取培养基上蓝色更深的单菌落进行km抗性平板筛选，筛选到xm296菌株的km抗性浓度为200μg/ml,然后将xm296进行发酵培养，通过高效液相色谱仪(hplc)检测发酵时间为36h、48h、60h、72h、84h、96h的发酵液靛蓝含量，发现发酵72h时靛蓝含量达到峰值，且较诱变前的双报告菌株靛蓝含量有明显提升。使用hplc检测发酵时间为120h、144h、168h、192h、216h的xm296和野生型wt菌株发酵液中的达托霉素产量，实验证明xm296在发酵216h时的达托霉素产量是wt的7.44倍。

8、本发明所述双报告菌株还可在其它链霉菌药物高产菌筛选中的应用。所述双报告菌株还包括用于其它放线菌药物高产菌的筛选以提高筛选效率，即使用报告基因来关注靶基因转录增加的突变体。

9、本发明首先以玫瑰孢链霉菌作为研究菌株，构建了遗传背景清晰、无特征红色素产生的δpksⅱδrppaδmelc敲除株，在敲除株合成基因簇的dpta前、dptd后分别原位插入显色报告基因idgs和kanamycin抗性报告基因neo，进而在基因簇原位构建了neo-idgs双报告系统菌株。对双报告菌株进行随机紫外诱变，通过菌落颜色和卡那霉素抗性初步筛选出显蓝色和抗性增加的菌株，进一步通过摇瓶发酵、高效液相色谱仪(hplc)确定诱变后的高产菌株xm296，达托霉素的摇瓶发酵产量提高了6.44倍。该报告基因导向策略很好地结合了沉默基因簇激活条件的筛选，并将产物与特定基因簇连接起来，并且有可能作为一种高通量的基因组挖掘方法。

10、除了用于激活沉默基因簇外，报告系统也可以用于筛选目标高产菌株以加快菌株发育，即使用报告基因来关注靶基因转录增加的突变体。该方法可用于解锁未知的复杂调控网络，这些网络通常调控次生代谢产物的生物合成。

11、与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

12、构建报告系统菌株将达托霉素表达信号转换为报告基因表达信号，然后利用这种信号转换促进突变体的选择。

13、传统上，菌株改良是通过迭代随机诱变和大规模筛选突变体来实现的,诱变和筛选的不合理性使得这种做法极其耗费人力。在生物合成基因簇的实际应用中，由于基因簇的表达是直接通过报告基因的表达来反映的，如果只有一个报告基因，不仅耗时，并且容易丢失包含高拷贝数目标簇的重组和选择假阳性重组，特别是在扩增大片段dna时。使用双报告基因引导重组选择(drgrs)可以克服这些问题。

14、质粒介导的报告系统在体内受表观遗传环境的调控且容易在多次传代过程中丢失，本课题构建的原位双报告系统不同于通常采用的质粒介导的报告系统，原位报告基因由于插入在基因簇特定位置且不破坏基因簇的功能，表达水平与被监测基因的表达水平保持一致，更能准确反映体内基因簇的真实表达情况且报告基因稳定存在于基因簇中不会因为传代而丢失。

15、本发明公开的报告系统已经在玫瑰孢链霉菌高效筛选达托霉素高产菌中得到有效应用，其建立的技术体系可以多次反复运用，迭代提高达托霉素合成效率；所运用的报告系统不仅可实现达托霉素的高产，还可广泛应用到其它链霉菌来源药物，对大品种链霉菌药物高产菌的高效筛选具有重要的应用价值。