一种基于BRET的甲基对硫磷生物传感器、构建方法及其应用

本发明属于水体农药残留检测领域，特别涉及一种基于bret的甲基对硫磷生物传感器、构建方法及其应用。

背景技术：

1、随着现代农业的发展，大量的甲基对硫磷(mp)类有机磷农药排放到水环境，给生态环境和人类健康带来了巨大威胁，亟需建立针对水体mp浓度的简便、快速且高灵敏度的方法，提高环境监测的效率，进而更有效的防范有机磷农药的危害。然而现有的mp检测方法存在诸多不足之处：基于仪器的分析方法操作复杂、耗时长、且需要昂贵的设备和训练有素的专业人员；基于酶的传感器方法受到各种化学物质的抑制，缺乏稳定性，并且持续需要底物源来量化农药水平。因此，有必要研发一种操作简便、快速、环境友好的检测mp的新方法。

2、近年来，基于生物发光-共振-能量转移(bret)的生物传感器由于其灵敏度高、能避免光漂白和自体荧光等优点已被广泛应用于医学、食品等领域。bret生物传感器由与配体特异性结合的敏感(识别)元件、生物发光供体及荧光受体组成。由于生物传感器与配体结合后会发生构象变化，影响生物传感器的光学性质，通过建立光学性质与配体浓度的相关关系即可实现配体化合物的识别与检测。

3、猝灭体(q-body)是一种基于抗体的免疫传感器，常通过用荧光染料标记scfv的n末端区域或抗体的抗原结合片段来构建。当具有短柔性接头肽的抗体n端标记的荧光染料进入抗体的可变区域时，由于染料的疏水性，可变区域中的色氨酸残基可通过从色氨酸到染料的光诱导电子转移引起的荧光猝灭来削弱染料的荧光。当q-body与抗原结合时，由于抗原依赖性fv稳定和结合抗原引起的空间位阻，猝灭的染料不能再停留在抗体内部并移动到外部，并恢复其荧光。荧光恢复的量随着结合抗原浓度的增大而增加，这是q-body传感器定量测定的基础。该技术易于操作，只需将样品添加到探针溶液中，即可在几秒钟到几分钟内测量荧光强度，具有简便、快速、灵敏度高等优点。

4、纳米荧光素酶(nluc)是一种来自深海虾的工程化萤光素酶，是一种体积小(19kda)、亮度高但稳定的蛋白质，与其他萤光素酶相比，它产生增强和持续的发光。因此，nluc可用于作为构建bret生物传感器检测的的生物发光供体。

技术实现思路

1、本发明通过对mp生物传感器进行设计，旨在提供一种基于bret的mp生物传感器、构建方法以及应用，通过以对甲基对硫磷特异性响应的单链可变区片段抗体(mp scfv)作为敏感元件，以纳米荧光素酶(nluc)为生物发光供体，以r6g马来亚酰胺荧光染料为荧光受体，构建了一种用于水体中甲基对硫磷检测的生物传感器，利用纳米荧光素酶(nluc)能够催化底物呋喃嗪产生450nm的生物发光，并通过共振能量转移激发r6g马来亚酰胺荧光染料产生560nm的发射光，当生物传感器结合甲基对硫磷后会发生基于q-body原理的r6g马来亚酰胺荧光染料的荧光恢复，以及r6g马来亚酰胺荧光染料与纳米荧光素酶nluc之间距离减小，导致纳米荧光素酶nluc与r6g马来亚酰胺荧光染料的bret比率改变，且bret比率变化的数值与结合的甲基对硫磷的浓度呈线性相关，由此可实现对甲基对硫磷的精准检测，解决现有甲基对硫磷检测方法存在复杂、耗时、需要昂贵的设备和训练有素的人员、缺乏稳定性等问题。

2、为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

3、一种基于bret的甲基对硫磷生物传感器，所述生物传感器为由对甲基对硫磷特异性响应的单链可变区片段抗体mp scfv、半胱氨酸标签cys-tag和纳米荧光素酶nluc融合表达得到的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示；其中，所述单链可变区片段抗体mpscfv与半胱氨酸标签cys-tag及纳米荧光素酶nluc通过柔性肽接头连接，所述单链可变区片段抗体mp scfv来源于预免疫小鼠噬菌体展示文库，其氨基酸序列如seq id no.1所示；所述半胱氨酸标签cys-tag偶联r6g马来亚酰胺荧光染料。将所述基于bret的甲基对硫磷生物传感器命名为r6g bret mp q-body。

4、优选的，所述柔性肽接头的氨基酸序列选自(yun h.，等，biotechnol.bioprocesseng，2022，27，820)，序列为5×glyglyglyglyser，即5×ggggs。

5、优选的，所述纳米荧光素酶nluc选自(hall，m.p.，等，acs chem biol，2012，7，1848)，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

6、优选的，所述r6g马来亚酰胺荧光染料为5,6-羧基罗丹明6g，c2-马来酰亚胺。

7、本发明目的之二在于提供上述基于bret的甲基对硫磷生物传感器的构建方法，包括以下步骤：

8、s1、质粒的合成：采用dna合成仪分别合成半胱氨酸标签cys-tag基因、单链可变区片段抗体mp scfv基因、p17-tag基因、flag-tag基因及his-tag基因，利用重叠延伸-聚合酶链式反应拼接技术，分别设计连接引物，扩增并按顺序依次组装，得到全长基因；将组装后得到的全长基因插入pet-24b(+)载体的bamhⅰ和hindⅲ位点之间，构建成pet-mp scfv；在pet-mp scfv的半胱氨酸标签cys-tag基因和单链可变区片段抗体mp scfv基因之间插入5×ggggs柔性接头基因，得到质粒，命名为pet-mp scfv-s5；采用gensmart在线工具对nluc基因进行密码子优化，然后将合成优化后的基因插入至pet-mp scfv-s5的cys-tag基因的n端，获得重组质粒pet-nluc-mp scfv；

9、s2、转化与表达：将步骤s1构建的重组质粒pet-nluc-mp scfv在感受态大肠杆菌菌株中转化，并涂布在卡那霉素抗性lb平板中培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆，挑选培养得到的单克隆菌株接种至卡那霉素抗性lb液体培养基中，培养至od600＝0.6～1.0，经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达后，离心，收集细菌；

10、s3、裂解与纯化：将收集的细菌重悬至tbs缓冲液中，向其中添加添加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(pmsf)和溶菌酶，超声裂解，离心收集沉淀，并用8m尿素变性缓冲液变性溶解，离心收集上清液，然后采用尿素梯度透析的方法对包涵体表达的蛋白进行复性；利用ni-nta层析柱进行纯化，得到nluc-mp scfv蛋白；

11、s4、荧光染料标记：将nluc-mp scfv蛋白和r6g马来亚酰胺荧光染料共同孵育标记，然后利用ni-nta层析柱和即用型sephadex重力脱盐柱去除过量的荧光染料；纯化并脱盐后得到生物传感器蛋白，即甲基对硫磷生物传感器。

12、优选的，步骤s2中，所述感受态大肠杆菌菌株为bl21(de3)、shuffle t7expresslysy、origami2(de3)或arcticexpress(de3)；所述卡那霉素抗性lb固体培养基的质量体积浓度为100μg/ml，所述卡那霉素抗性lb液体培养基的质量体积浓度为50μg/ml；所述诱导表达条件为：0.1～1mm iptg，温度为16～30℃，转速为100～200rpm；所述在卡那霉素抗性lb液体培养基中培养条件：温度为

13、30～37℃，转速为100～200rpm。

14、优选的，步骤s3中，所述裂解条件为：裂解温度为0～4℃，功率为100～150w，裂解时间为15～30min；所述尿素梯度透析条件为：每隔12h依次替换一次含1～2mm氧化和还原型谷胱甘肽的4m尿素缓冲液、两次2m尿素缓冲液和两次不含尿素的缓冲液。

15、优选地，步骤s4中，所述nluc-mp scfv蛋白与r6g马来亚酰胺荧光染料的摩尔比为1：20～1：10；所述nluc-mp scfv蛋白和r6g马来亚酰胺荧光染料共同孵育时的温度为0～4℃，孵育时间为12～16h。

16、本发明的目的之三在于提供上述基于bret的甲基对硫磷生物传感器在水体中甲基对硫磷检测中的应用。

17、优选的，将上述基于bret的甲基对硫磷生物传感应用于水体中甲基对硫磷检测的方法，包括如下步骤：

18、a1、采集水样：对待测水体进行取样，得到水体样本，过滤，得到待测水样试样；

19、a2、配制检测缓冲液、呋喃嗪使用液、甲基对硫磷标准使用液及生物传感器蛋白溶液，备用；

20、a3、配制甲基对硫磷标准溶液：吸取不同体积的甲基对硫磷标准使用液于离心管中，用超纯水或者含1％丙酮的超纯水稀释配制成浓度为0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml、3000ng/ml、10000ng/ml、30000ng/ml、100000ng/ml的甲基对硫磷系列标准溶液；

21、a4、绘制标准曲线：将步骤a2中配制的甲基对硫磷系列标准溶液分别置于白色酶标板中，向其中加入生物传感器蛋白溶液和呋喃嗪使用液，得到生物发光共振能量转移检测体系，在生物发光光谱扫描模式下测定生物发光光谱，然后选择位于450nm和560nm处的两处峰值强度并根据下式(1)计算bret比率，再以bret比率为纵坐标，以mp标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；

22、

23、将绘制的曲线进行非线性拟合，得到拟合方程，见下式(2)：

24、

25、式中，bretmax为bret比率的最大值，bretmin为bret比率的最小值，x为mp标准溶液的浓度，x0为拟合参数，h为hill斜率，s为控制因子；

26、a5、获得待测水样中甲基对硫磷浓度：将待测水样试样代替甲基对硫磷标准溶液，重复步骤a3，得到生物发光共振能量转移检测体系，在生物发光光谱扫描模式下测定生物发光光谱，通过式(1)和式(2)，计算得到待测水样中甲基对硫磷浓度。

27、优选的，步骤a2中，所述检测缓冲液由10～100mm tris与50～250mm nacl混合得到，ph为7.4；所述生物传感器蛋白溶液的工作浓度为1～20nm，所述呋喃嗪使用液的工作浓度为10～20μm；所述生物发光共振能量转移检测体系中，所述甲基对硫磷标准溶液、生物传感器蛋白溶液和呋喃嗪使用液的体积比为4：1：1；所述在生物发光光谱扫描模式下的参数设置：波长为400～600nm，步长为10nm。

28、优选的，所述水样包括纯水、自来水和地表水。

29、与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

30、(1)本发明通过在对甲基对硫磷(mp)特异性响应的单链可变区片段抗体mp scfv的n端插入半胱氨酸标签cys-tag和纳米荧光素酶nluc，且单链可变区片段抗体mp scfv与半胱氨酸标签cys-tag及纳米荧光素酶nluc均通过柔性肽(序列为5×ggggs)接头连接，然后利用半胱氨酸标签cys-tag偶联r6g马来亚酰胺荧光染料，从而构建了生物传感器mp q-body bret传感器，该生物传感器对甲基对硫磷具备较好的选择性，通过耦合生物发光共振能量转移技术，能够将mp浓度信号转换为比率荧光信号输出，实现对水体中甲基对硫磷的快速、灵敏检测，且检测结果具备较低的检测限和较宽的检测范围，即本发明构建的甲基对硫磷生物传感器对水体中甲基对硫磷的检测具有更高的准确性。

31、(2)本发明通过进行加标回收率实验，得到结果表明本发明构建的甲基对硫磷生物传感器适用于纯水、自来水和地表水(景观河水)等不同环境水体中甲基对硫磷的检测。