一株降解玉米赤霉烯酮罗伊氏短芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，具体是涉及一株降解玉米赤霉烯酮罗伊氏短芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen/zea)，又称f-2毒素，是一种非甾类霉菌毒素，主要由镰刀菌产生，玉米、小麦、大麦和燕麦等谷物发生霉变易感染镰刀菌而被玉米赤霉烯酮污染。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用，动物食用受污染的饲料，吸收的玉米赤霉烯酮，在体内能与雌激素竞争结合相应受体(er)，激活下游反应元件，引发雌激素受体二聚化，进而产生一系列的拟雌激素效应，造成动物体内雌激素水平紊乱，破坏动物尤其是母猪的生殖系统。玉米赤霉烯酮中毒分为急性中毒和慢性中毒。在急性中毒的条件下，对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用。主要的机理是它会造成神经系统的亢奋，在脏器当中造成很多出血点，使动物突然死亡。玉米赤霉烯酮还具有很强的致癌性，可通过动物的摄入影响人类可食用的肉制品和奶制品，对人类的健康造成严重威胁。

2、霉菌毒素污染一直是全球畜牧业和食品工业的重大威胁。目前，对动物玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗。玉米赤霉烯酮在体内有一定的残留和蓄积，一般毒素代谢出体外的时间为半年之久，造成的损失大、时间长。所以，玉米赤霉烯酮的污染已经成为食品和饲料工业中的重要问题。

3、为了避免玉米赤霉烯酮通过饲料、食品原料等方式进入食物链，除了加大对于饲料、食品原料等的监管和检测力度，还可以通过一些方法降低或去除玉米赤霉烯酮。降解玉米赤霉烯酮及其衍生物的方法主要包括化学法、物理法和生物法。化学法主要是通过强酸强碱如臭氧、过氧化氢、碳酸钠等化学试剂与玉米赤霉烯酮发生化学反应，将其转变成其他低毒甚至无毒物质。虽然化学法脱毒效率高，但反应过程容易产生其他有害物质造成二次污染，因此，化学法在实际生产中使用范围并不广。物理法主要是高温法、辐射法、高压法及吸附法等。通过高温处理，紫外照射可破坏玉米赤霉烯酮的结构达到减少谷物及饲料中玉米赤霉烯酮含量的目的。吸附剂主要是活性炭，铝硅酸盐类矿物质如蒙脱石等通过静电吸附力和分子间作用力与玉米赤霉烯酮结合形成大分子排出动物体外或从饲料及食品原料中去除(赵琳等，2016)。然而，这些技术只是部分有效，不能完全去除玉米赤霉烯酮，并且由于其高成本和低效率而使工业应用受到阻碍。化学和物理处理也会破坏谷物和饲料的营养成分，会引入二次污染。相比之下，生物法具有环保，高效，成本低等优点，更重要的是不会对食品或饲料原料造成二次污染。因此，这种方法在食品和饲料工业中显示出巨大的前景。生物法主要是通过微生物降解或通过酶降解玉米赤霉烯酮。目前分离到的能降解玉米赤霉烯酮的菌株较少，并且各个菌株对玉米赤霉烯酮的降解能力也有一定的差异，因此非常有必要挖掘新的可降解玉米赤霉烯酮的微生物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于为了挖掘新的可降解玉米赤霉烯酮的菌株，降低玉米赤霉烯酮污染饲料对家畜的伤害，提供一株降解玉米赤霉烯酮罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillusreuszeri)rf10-5。

2、本发明的另一目的在于提供所述罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

3、本发明的第三目的在于提供所述罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5在制备饲料添加剂中的应用，

4、所述罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5已于2022年12月13日保存于位于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 20221968，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。

5、所述罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5的16s rdna序列如seqid no.1所示。

6、所述罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5由以下方法获得：

7、1)菌株分离：

8、吸取1ml福建红曲醋样品加入99ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，150rpm摇床富集培养1d；采用10倍稀释法制备梯度为10-1～10-5的富集菌液稀释液，取10-3、10-4、10-5浓度梯度稀释液各100μl分别涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上并置于37℃培养1d；

9、2)菌株纯化：

10、选取菌落分离较好的平板，在平板上挑取多个单菌落分别进行平板划线，置于培养箱中37℃培养1d，选取单克隆重复一次；

11、3)降解玉米赤霉烯酮：

12、牛肉膏蛋白胨培养基9ml(含玉米赤霉烯酮5μg/ml)，加入1ml的分离菌株发酵液作为实验组；同时设置空白对照(含玉米赤霉烯酮5μg/ml牛肉膏蛋白胨培养基，不接菌)；37℃150rpm摇床24h后，通过hplc的方法分析玉米赤霉烯酮降解情况，最终筛选获得具有高效降解玉米赤霉烯酮能力的单一菌株，brevibacillus reuszeri rf10-5。

13、本发明提供一种含brevibacillus reuszeri rf10-5的发酵液，每毫升所述发酵液中含有活菌浓度为108～9cfu/ml的罗伊氏短芽孢杆菌brevibacillus reuszeri rf10-5。

14、本发明提供一种含brevibacillus reuszeri rf10-5的发酵液的制备方法；所述方法具体包括以下步骤：

15、1)制备种子液

16、将罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5经活化后接种于牛肉膏蛋白胨培养基中培养，37℃180rpm摇床不少于12h，获得罗伊氏短芽孢杆菌rf10-5的活菌浓度为108-9cfu/ml的种子液；

17、2)制备发酵液

18、将步骤1)得到的种子液按2％的接种比例接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行扩大培养，37℃180rpm摇床不少于12h，得到活菌浓度为108-9cfu/ml的发酵液。

19、本发明提供一种含brevibacillus reuszeri rf10-5的发酵液在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

20、本发明提供一种含brevibacillus reuszeri rf10-5的发酵液在降解谷物中玉米赤霉烯酮的应用。所述应用的具体方法可为：

21、将活菌浓度为108-9cfu/ml的含brevibacillus reuszeri rf10-5的发酵液，按质量比2︰100的配比喷施于玉米赤霉烯酮污染的谷物中，混合均匀后，35℃下反应24h。

22、本发明提供brevibacillus reuszeri rf10-5在制备饲料添加剂中的应用，用于降解饲料中玉米赤霉烯酮毒素。

23、与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：

24、本发明获得一株具有较好降解玉米赤霉烯酮能力的罗伊氏短芽孢杆菌菌株，将其命名为：罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5。该菌株(brevibacillusreuszeri)rf10-5能够高效降解玉米赤霉烯酮毒素，降解率可达99.8％，解毒活性高，可用于饲料等产品中玉米赤霉烯酮毒素的降解，极大地降低玉米赤霉烯酮对动物繁殖性能等的危害，改善动物生产性能。同时，罗伊氏短芽孢杆菌(brevibacillus reuszeri)rf10-5来源于食醋，用于饲料添加剂不存在风险，对环境没有污染，应用前景广阔。