甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白在控制甜瓜果实含糖量中的应用

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白在控制甜瓜果实含糖量中的应用，申请人自从甜瓜(cucumis melo l.)中分离、克隆得到一个甜瓜果实蔗糖积累调控关键基因cmfla1，在甜瓜果实中敲除或降低该基因的表达，显著提高果实中的蔗糖含量，该基因可用于甜瓜果实品质改良。

背景技术：

1、束状阿拉伯半乳聚糖蛋白(fasciclin-like arabinogalactan proteins，flas)属于阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins，agps)家族的亚族。agps是高度糖基化的蛋白，存在于质膜、细胞壁、细胞外基质和分泌物中(如柱头表面和伤流中)(elliset al.,2010)。而flas蛋白除了有1-2个agp motifs外，跟其他agp亚族不同的是，还具有1-2个独特的fasciclin(fas)domains(huber and sumper,1994；kim et al.,2002；johnsonet al.,2003；faik et al.,2006；showalter et al.,2010)。对拟南芥atfla4的结构分析表明fas1 domain用于维持质膜定位；而糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,gpi)修饰信号负责将蛋白从内质网运出后锚定到膜上；n-糖基化用于蛋白从内质网运出，而o-糖基化会影响分泌后蛋白的去向(xue et al.,2017)。

2、flas参与植物生长发育，如纤维发育(huang et al.,2013；liu et al.,2013；wang et al.,2015；guerriero et al.,2017)、生殖生长(li et al.,2010；tan et al.,2012；miao et al.,2021；deng et al.,2022)、细胞壁再生(showalter et al.,2016)和对环境的响应(ma and zhao,2010；takahashi et al.,2016；cagnola et al.,2018；meng etal.,2020)。拟南芥中关于fla基因的研究较多，atfla1在芽再生和侧根发育中起作用(johnson et al.,2011)；atfla18调控根伸长(allelign ashagre et al.,2021)。而atfla11、12和16参与茎发育和分化(ito et al.,2005；macmillan et al.,2010；liu etal.,2020)。另外atfla3和atfla14特异在花粉粒中表达，并且对于花粉发育具有关键作用(li et al.,2010；miao etal.,2021)。还有一些fla基因响应胁迫：例如fla4响应盐胁迫并且影响细胞间粘附(shi et al.,2003)；而干旱会诱导fla9的表达并且增加玉米和拟南芥种子败育率(cagnola et al.,2018)。然而关于fla基因在果实糖积累中的作用还未见报道。

3、甜瓜(cucumis melo l.)是葫芦科中重要的园艺作物，果实是其产品器官。本发明克隆了一个甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白基因，命名为cmfla1，发现该基因的表达和甜瓜果实蔗糖含量呈负相关，通过实验证明cmfla1是一个负调控甜瓜果实蔗糖含量的基因。通过对国内外专利文献、期刊杂志及其他公开发表的文献(如互联网)进行检索，本发明在国内外未见报道，我们也未公开发表涉及本
技术实现要素：
的文章，本发明在国内外公众未知。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白或甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的编码基因在控制甜瓜果实含糖量中的应用，所述的甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白为seq id no.2所示。

2、本发明的另一个目的在于提供了甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白或甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的编码基因在甜瓜果实品质改良中的应用，通过将甜瓜果实中甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的编码基因敲除或降低该基因的表达，可显著提高果实中的蔗糖含量。

3、本发明的最后一个目的在于提供了甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白活性抑制剂在提高甜瓜果实甜度中的应用。

4、为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

5、申请人基于植物基因克隆技术从甜瓜中克隆得到一个cmfla1基因，其核苷酸序列为seq id no.1所示，其对应的氨基酸序列如seq id no.2所示；开放阅读框(orf)预测，发现该基因含一个orf，长度为1245bp，编码414个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量预测为44.15kda，等电点为5.88。申请人设计一对引物，以甜瓜果实cdna为模板，利用pcr技术克隆得到上述基因cmfla1的编码区全长序列。引物如下：

6、cmfla1-f：5'-atgctgctgcaactctgccgcggcgccgccgccgggt-3'

7、cmfla1-r：5'-ttacactagaagaagcgctgccaaacctgaag-3'。

8、本发明的保护范围包括：

9、甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白或甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的编码基因在控制甜瓜果实含糖量中的应用，所述的甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白为seq id no.2所示；

10、以上所述的应用，具体为：

11、抑制或降低甜瓜中束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的表达来提高甜瓜果实含糖量；

12、敲除、抑制或沉默甜瓜中束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的编码基因来提高甜瓜果实含糖量；

13、提高甜瓜中束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的表达量来降低甜瓜果实含糖量；

14、提高甜瓜中束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的编码基因的表达量来降低甜瓜果实含糖量；

15、以上所述的应用中，优选的，是通过将抑制或降低甜瓜中束状阿拉伯半乳聚糖蛋白表达量的物质导入甜瓜中；所述的物质为抑制或降低甜瓜中束状阿拉伯半乳聚糖蛋白的核酸分子、或其表达框、重组载体、重组微生物。

16、以上所述的应用中，优选的，所述的敲除采用的是crispr/cas9系统，所述系统中grna的靶位点为：atcttgccgtctcaagtgg。

17、以上所述的应用中，优选的获得的果实含糖量提高的甜瓜，含有seq id no.3、seqid no.4或seq id no.5所示基因。

18、上述应用，同样适用于甜瓜果实品质改良。

19、本发明的保护范围还包括：

20、甜瓜束状阿拉伯半乳聚糖蛋白活性抑制剂在提高甜瓜果实甜度中的应用；

21、以上所述的应用中，优选的，所述的抑制剂为β-葡萄糖基-yariv。

22、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

23、首次发现束状阿拉伯半乳聚糖蛋白具有调控蔗糖积累的功能，丰富了该家族基因在植物果实品质调控中的作用，为甜瓜果实品质改良和分子设计育种提供新的基因资源，为实现甜瓜生产的精准调控提供新思路。