一株用于外源基因表达的枯草芽孢杆菌分离株及其用途

本发明属于基因工程，具体涉及一株用于外源基因表达的枯草芽孢杆菌分离株及其用途。

背景技术：

1、柔嫩艾美耳球虫(eimeria tenella)主要寄生于鸡的盲肠，呈世界性分布，其生活史由孢子生殖、裂殖生殖及配子生殖三个阶段组成。柔嫩艾美耳球虫卵囊排出体外后，经口摄入宿主消化道，释放出子孢子，后者入侵宿主的肠绒毛上皮细胞，造成大量破坏和损伤，从而出现一系列症状甚至死亡。鸡只感染球虫后，羽毛杂乱，鸡冠发白，精神沉郁，畏寒，下痢，生长发育迟缓，明显消瘦，粪便由橘色逐渐发展为血便。急性感染者通常在发病后的1-2天出现死亡。鸡球虫主要攻击3月龄以内的雏鸡，尤其以50日龄以下的雏鸡发病率和病死率最高。一经感染难以痊愈，这样一方面对鸡的增重和生产性能产生较大的影响；另一方面，感染者免疫力下降，易导致继发感染，从而进一步对禽养殖业造成危害。

2、球虫病呈全球流行趋势，每年因此病造成的经济损失超过30亿美元，目前的控制方法主要依赖于抗球虫药和球虫疫苗。全世界每年的抗球虫药耗费高达3.2亿美元，而中国每年相应支出为6-18亿元人民币，并呈逐年上升趋势。抗球虫药的使用不但大幅度增加了禽的养殖成本，且带了药物残留、环境污染和耐药性等一系列问题。鸡球虫苗主要有活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组卡介苗及佐剂疫苗等。致弱球虫苗是目前为止研发最成熟、商业化程度最高的疫苗，这在一定程度上克服了抗球虫药的弱点，但是疫苗制作和接种过程繁琐，本身也存在毒力恢复或返强等隐患。因此，需要进一步开发成本低廉、接种流程简单、安全高效的新型疫苗。

3、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)隶属于芽孢杆菌属，有鞭毛、无荚膜、活性强、繁殖快、营养简单、且耐高温、耐酸碱、适应能力强，是一种好氧易形成芽孢的革兰氏阳性菌。此类菌可刺激机体免疫器官的生长发育，提高肠黏膜中siga含量和细胞因子表达水平，活化全身的免疫系统，增强机体的抗病能力，减少疾病的发生，因此常被用于动物饲料中，是公认的安全的可直接食用的益生菌。此外，枯草芽孢杆菌比大肠杆菌具有更好的发酵能力，可产生大量异源蛋白，并将其分泌到培养基中。近年来通过枯草芽孢杆菌进行外源表达的技术在防治渔业寄生虫病上得到了广泛应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株用于外源基因表达的枯草芽孢杆菌分离株及其用途。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明涉及一种枯草芽孢杆菌重组菌，以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs2为出发菌株，以柔嫩艾美耳球虫etmic2为靶点构建重组质粒，转化到bs2感受态细胞中，获得所述重组菌。

4、作为一个实施方案，所述重组质粒是通过包括如下步骤的方法构建而得：

5、s1、用bamh i和xho i酶对pbe2-r质粒进行双酶切；

6、s2、将etmic2片段连接到酶切过的pbe2-r质粒中，并转染dh5α；经测序得到阳性克隆后，提取质粒，即重组质粒，记为pbe2-r-etmic2。

7、作为一个实施方案，用kpn i和ecor i分别对pbe2及pwb980质粒进行双酶切，获得pbe2质粒和p43启动子；将两者连接获得pbe2-r质粒。

8、作为一个实施方案，所述etmic2片段是通过包括如下步骤的方法获得：

9、a1、收集柔嫩艾美耳球虫感染的雏鸡粪便，加水搅拌过滤，饱和盐水反复清洗后，加2.5％重铬酸钾，使卵囊孢子化；抽提rna，反转录为cdna；

10、a2、以所述cdna为模板，以etmic2-f和etmic2-r为引物，以kod-plus-neo酶扩增得到etmic2片段。

11、作为一个实施方案，etmic2-f序列为5’-gaagtaacgacaatgggatccatggctcgagcgttgtcg-3’；etmic2-r序列为5’-gtggtggtggtggtgctcgagtcaggatgactgttgagtgtcactc-3’。

12、作为一个实施方案，所述bs2感受态细胞是通过包括如下步骤的方法制备而得：

13、b1、将枯草芽孢杆菌bs2新鲜单菌落接种于生长培养基，过夜培养；再按1：50-100接种生长培养基，振荡培养至od600为0.85-0.95；

14、b2、菌液冰水浴10-30min，4 -10℃离心收集菌体；预冷的电击缓冲液反复洗涤菌体后重悬，冻存，即可。

15、作为一个实施方案，所述生长培养基：胰蛋白胨1-2g，氯化钠1-2g，酵母粉0.5 -1g，山梨醇9.1 -10g，加ddh2o定容至100 -150ml，ph调节至7.7-7.8，121℃高压灭菌15-20min。

16、作为一个实施方案，所述电击缓冲液：山梨醇9.1-10g，甘露醇9.1 -10g，甘油10 -15ml，加ddh2o定容至100-110ml，121℃高压蒸汽灭菌20-25min。

17、作为一个实施方案，冻存后使用前需复苏。所述复苏培养基：胰蛋白胨1-1.5g，氯化钠1-1.5g，酵母粉0.5-1g，山梨醇9.1-10g，甘露醇6.9-7.9g，加ddh2o定容至100-110ml，ph调节至7.5-8.0，121℃高压灭菌15-20min。

18、本发明还涉及一株用于外源基因表达的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs2，其保藏编号为cctcc m 2023877。

19、本发明还涉及一种枯草芽孢杆菌重组菌bacillus subtilis bs2pbe2-r-etmic2(本发明中也表示为bacillus subtilis bs2pbe2-r-etmic2)，其保藏编号为cctcc m 2023876。

20、本发明还涉及一种上述枯草芽孢杆菌重组菌，或枯草芽孢杆菌重组菌bacillussubtilis bs2pbe2-r-etmic2在制备抗柔嫩艾美耳球虫感染药物中的用途。

21、本发明还涉及一种上述枯草芽孢杆菌重组菌，或枯草芽孢杆菌重组菌bacillussubtilis bs2pbe2-r-etmic2在制备抗柔嫩艾美耳球虫疫苗中的用途。

22、本发明具有如下有益效果：

23、1)本发明分离和鉴定获得了一株枯草芽孢杆菌bs2，经16s rrna比对，发现其与gd3b株高度同源。

24、2)本发明以柔嫩艾美耳球虫etmic2为靶点构建重组质粒pbe2-r-etmic2，转化到bs2感受态细胞中；获得的重组菌bs2pbe2-r-etmic2可高效表达分泌型的etmic2蛋白，且口服接种后，引起体液免疫和细胞免疫，表现出优秀的抗球虫效果，可进一步开发成有潜力的抗球虫疫苗。

25、本发明的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs2，归属于厚壁菌门(firmicutes)，芽孢杆菌科(bacillaceae)，芽孢杆菌属(bacillus)，其微生物保藏编号为：cctcc m2023877；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2023年05月30日；保藏地址：武汉大学。

26、枯草芽孢杆菌重组菌bacillus subtilis bs2pbe2-r-etmic2，其保藏编号为：cctccm2023876；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2023年05月30日；保藏地址：武汉大学。