一种构巢曲霉底盘细胞构建的方法

本发明涉及微生物工程，尤其涉及一种构巢曲霉底盘细胞构建的方法。

背景技术：

1、构巢曲霉属丛梗孢科、曲霉属的一种真菌，但存在有性阶段，构巢曲霉，质控菌种，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的atcc、cmcc、cicc和dsmz标准菌株；天然产物在现代疾病治疗与防治中依然发挥着重要作用，一直是许多新药制剂或药物先导化合物的重要来源；如今，一些治疗重大疾病，如癌症、感染性疾病、代谢紊乱、免疫缺陷的药物依然主要来源于天然产物或其类似物，如构巢曲霉，从天然产物的来源来看，微生物次生代谢产物是天然药物或先导化合物的重要来源，微生物能够产生结构复杂多样、活性广泛显著的次生代谢产物。

2、现有的中国专利(公开号cn113652443a)公开了菌株及其发酵生产麦角生物碱的应用；以构巢曲霉为底盘细胞，异源重构的麦角生物碱的生物合成途径，获得了9种不同结构的麦角生物碱化合物和2种途径中间体。通过途径优化、前体供应、p450电子传递链优化获得多株麦角生物碱高产菌株。基于上述，本发明实现了在构巢曲霉中异源高产麦角生物碱类化合物。

3、上述菌株及其发酵生产麦角生物碱的应用在应用过程中，微生物次生代谢产物是天然药物或先导化合物的重要来源，微生物能够产生结构复杂多样、活性广泛显著的次生代谢产物，如临床上使用的阿司匹林、环洛伐他汀、紫杉醇、吗啡等，成为人们进行新药研发的重要研究对象，因此需要提升构巢曲霉底盘细胞构建后具有显著生物活性，以更好的用于如抗肿瘤、抗真菌等医药用途。

4、为此，有必要提供一种构巢曲霉底盘细胞构建的方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种构巢曲霉底盘细胞构建的方法，解决了现有菌株及其发酵生产麦角生物碱的应用在应用过程中，难以提升生物活性的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的一种构巢曲霉底盘细胞构建的方法，包括制备培养基、发酵培养、硅胶柱层析分离、分子筛过滤、以非极性基团为固定相反相柱层析和细胞恢复构建培养，所述发酵培养通过自然光照静置发酵三十天，所述硅胶柱层析分离、分子筛过滤和以非极性基团为固定相反相柱层析的方法包括以下步骤：

3、s1、硅胶柱层析分离：根据硅胶对物质的吸附力不同而达到分离目的，极性大的物质容易被硅胶吸附，极性较小的物质不易被硅胶吸附。

4、s2、分子筛过滤：通过利用分子筛效应过滤分离物质，所用载体为具有三维网状结构的sephadex-lh-20，当在有机溶剂中充分溶胀后装入色谱柱中，加入样品混合物，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子物质不能进入到凝胶颗粒内部网孔中，在颗粒间隙流动，随着洗脱剂一起从柱底流出，小分子化合物因为能够进入凝胶颗粒内部，而后流出；从而样品按分子量从大到小先后流出凝胶色谱柱。

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6、s3、以非极性基团为固定相反相柱层析：通过十八烷基、辛烷基、甲基与苯基，以及流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或者无机盐缓冲溶剂，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出，恰好与正向法相反。

7、s4、细胞恢复构建培养：在无菌厌氧条件下，用无菌吸管加0.3ml无菌水于安瓿管内，使菌种块溶化呈悬浮状，另取无菌吸管取0.1ml悬浮液于己制备好的适宜该菌生长的斜面培养基上涂匀。

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9、优选的，在步骤s1中)通过二氯化碳将待分离的样品充分溶解，与能充分吸附该样品量的100～200目硅胶搅拌均匀，挥干溶剂，得到柱层析所用样品；根据拌样量硅胶量的多少，装入适量300～400目的硅胶，并使拌样的硅胶高度与固定相填料的高度比为1:15，用真空泵抽匀、抽实，将拌样得到的硅胶样品在层析柱上表面均匀铺撒，再用真空泵抽匀、抽实，然后在样品上表面添加保护层硅胶和脱脂棉；根据tlc薄层板中化合物的比移值(rf值)不同，所要得到的化合物的rf值大小，选择洗脱剂并按极性从小到大的顺序，选择不同的梯度连续洗脱，收集洗脱剂组分；通过薄层层析分析法显色后，把含有相同rf值并且显色相同的组分合并在一起；合并到一起的各个组分分别用旋转蒸发仪于40℃左右减压浓缩，得到浓缩浸膏或干粉颗粒。

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11、优选的，在步骤s2中)所用的凝胶为葡聚糖凝胶sephadex lh-20，凝胶在使用前用甲醇充分溶涨，装柱完成后再用三倍柱体积的洗脱液置换；并将浓缩后的样品用尽量少的溶剂充分溶解(样品用初始洗脱剂溶解)，上样结束后，使样品全部进入柱内再用尽量少的洗脱液清洗漏斗及柱壁，待样品完全进入柱材料中时，缓缓加入洗脱液(甲醇，甲醇与二氯甲烷的混合溶剂)，调至合适的流速(流速与柱长度和直径有关系)，常压过柱；通过薄层层析分析法显色后，把含有相同rf值并且显色相同的组分合并在一起；合并到一起的各个组分分别用旋转蒸发仪于40℃左右减压浓缩，得到浓缩浸膏或干粉颗粒。

12、优选的，在步骤s3中)填料为rp-c18，选择直径、长度较长的玻璃层析柱，将适量rp-c18填料和起始梯度的洗脱剂混悬(甲醇)后进行装填；用起始梯度的洗脱剂(不同浓度的甲醇或丙酮)平衡柱子；将样品用适量起始梯度的洗脱剂完全溶解，用漏斗过滤后，液体上样；根据tlc薄层板中化合物的比移值不同，所要得到的化合物的比移值大小，通过洗脱剂，按极性从大到小的顺序进行洗脱，通过薄层层析法显色后，把含有相同rf值并且显色相同的组分合并在一起，合并到一起的各个组分分别用旋转蒸发仪于40℃左右减压浓缩，得到浓缩浸膏或干粉颗粒。

13、与相关技术相比较，本发明提供的一种构巢曲霉底盘细胞构建的方法具有如下有益效果：

14、1)通过制备培养基、发酵培养、硅胶柱层析分离、分子筛过滤、以非极性基团为固定相反相柱层析和细胞恢复构建培养来对构巢曲霉底盘细胞构建，通过自然光照静置发酵三十天，根据硅胶对物质的吸附力不同而达到分离目的，极性大的物质容易被硅胶吸附，极性较小的物质不易被硅胶吸附。

15、2)通过利用分子筛效应过滤分离物质，所用载体为具有三维网状结构的sephadex-lh-20，当在有机溶剂中充分溶胀后装入色谱柱中，加入样品混合物，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子物质不能进入到凝胶颗粒内部网孔中，在颗粒间隙流动，随着洗脱剂一起从柱底流出，小分子化合物因为能够进入凝胶颗粒内部，而后流出；从而样品按分子量从大到小先后流出凝胶色谱柱。

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17、3)以非极性基团为固定相反相柱层析，通过十八烷基、辛烷基、甲基与苯基，以及流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或者无机盐缓冲溶剂，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出，恰好与正向法相反，填料为rp-c18，选择直径、长度较长的玻璃层析柱，将适量rp-c18填料和起始梯度的洗脱剂混悬(甲醇)后进行装填；用起始梯度的洗脱剂(不同浓度的甲醇或丙酮)平衡柱子；将样品用适量起始梯度的洗脱剂完全溶解，用漏斗过滤后，液体上样；根据tlc薄层板中化合物的比移值不同，所要得到的化合物的比移值大小，通过洗脱剂，按极性从大到小的顺序进行洗脱，通过薄层层析法显色后，把含有相同rf值并且显色相同的组分合并在一起，合并到一起的各个组分分别用旋转蒸发仪于40℃左右减压浓缩，得到浓缩浸膏或干粉颗粒。

18、4)细胞恢复构建培养，在无菌厌氧条件下，用无菌吸管加0.3ml无菌水于安瓿管内，使菌种块溶化呈悬浮状，另取无菌吸管取0.1ml悬浮液于己制备好的适宜该菌生长的斜面培养基上涂匀。

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