幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1及其制备方法和用途

本发明属于生物制药领域，具体涉及幽门螺杆菌重组蛋白caga1及其制备方法和用途。

背景技术：

1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori,hp)是微需氧螺旋形革兰氏阴性菌，已被世界卫生组织列为ⅰ类致癌物，是多种消化道疾病的危险因素，也是引起胃、十二指肠溃疡及胃癌等疾病的常见病菌。目前通过质子泵抑制剂(ppi)和胃黏膜保护剂，并结合三联或四联疗法进行临床治疗，但随着细菌耐药问题的日益加剧，目前的临床治疗手段疗效受限，急需研制有效的疫苗进行预防和治疗。

2、细胞毒素相关基因a蛋白(cytotoxin-associated gene a，caga)属于外膜蛋白，为hp主要的毒力因子之一。蛋白caga由细胞毒素相关基因致病岛编码的ⅳ型分泌系统(typeⅳsecretion systems，t4ss)转运到胃黏膜上皮细胞，通过侵入上皮细胞基质，使细胞形态发生改变，影响其增殖和凋亡过程，进而引起炎症反应。不同hp菌株的caga基因长度不等，约3444～5925bp，通常可分为n末端保守区(约占70％)和c末端可变区(约占30％)，可变区存在数目不等的重复序列。西方国家的hp菌株caga基因携带率为60～70％，而亚太地区国家hp菌株caga基因携带率通常高达90％以上。

3、目前还未有研究报道hp菌株的caga1蛋白是否可以作为特异性抗原引起机体免疫反应。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题为：目前hp疫苗的研究主要集中在尿素酶urea、ureb或空泡毒素vaca等毒力因子上，还未见有对caga1蛋白是否能作为疫苗抗原成分的研究。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1。所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1，氨基酸序列如seq id no:1所示。

3、seq id no:1抗原caga1的氨基酸序列

4、mgtnetidqqpqteaafnpqqfisydpdqkpivdkndrdnrqafdgisqlreeysnkaiknptkknqyfsdfinksndlinkdalidvesstksfqkfgdqryqiftswvshqndpskintrsirnfmehtiqppipddkekaeflksakqsfagiiignqirtdqkfmgvfdeslkerqeaeknggstggdwldiflsfifdkkqssdvkeainqepvphiqpdiatstthiqglppesrdlldergnfskftlgdmemldvegvadmdpnykfnqllihnntlssvligshdgiepekvsllyagnggfgdkhdwnatvgykdqqgnnvatiinvhmkngsglviaggekginnpsfylykedqltgsqralsqeeilnkidfmeflaqnnakldnlsekekekfqneikdfqkdskpyldalgndriafvskkdpkhsalsnfkytnaskspnkgvgvtngvshleagfskvavfnlpnlnnlaitsvvrrle。

5、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1中，编码核苷酸序列如seq id no:2所示。

6、seq id no:2抗原caga1的编码核苷酸序列

7、ccatgggcaccaatgaaaccatcgaccagcaacctcagacggaagcagctttcaatccgcaacagtttatttcttatgatcccgaccaaaagccaattgtagataagaacgatcgtgataatcgtcaggctttcgacggaatttcgcaacttcgcgaggagtactcgaataaagcaatcaagaatcccacgaagaagaaccagtatttcagtgattttatcaataaatcgaacgaccttattaataaagacgcccttatcgacgttgagtcttcgaccaagtcatttcagaagttcggagatcagcgctatcaaatctttacctcctgggtatcacaccagaacgaccctagtaaaatcaacacgcgtagcatccgcaattttatggaacatacgatccagccgcccattccagacgataaggagaaagcggagttcctgaaaagcgcgaagcaatcttttgcggggattatcattggaaaccagatccgtacggatcaaaagttcatgggcgtatttgacgaaagtctgaaagagcgccaggaagcggagaagaacggtggatctacgggtggagattggctggacattttcctgtccttcatcttcgacaagaaacaatcgagcgatgtaaaggaagccattaatcaggaacctgtaccccatattcaacctgatattgccacgagcaccacgcacattcaaggattgccgcccgagtcgcgcgaccttcttgatgagcgcgggaatttctctaagttcacgcttggggacatggagatgttggacgtggagggcgttgccgacatggaccccaattacaagtttaaccaattgttaattcataacaacacactttcatccgttcttattggatcgcacgacgggatcgaacccgaaaaggtctcgttgttgtatgcaggaaatggaggttttggtgataagcacgattggaacgctacggtcgggtataaagaccaacaaggaaacaacgtcgccacgatcatcaatgtccacatgaagaatggtagtggtcttgtcattgcaggcggcgagaaggggattaataacccgtcattttacttatataaagaggaccaattaactggttcgcaacgtgcactgtctcaggaagagatccttaacaagattgactttatggagtttctggctcagaacaatgctaaacttgacaacctttcggagaaagaaaaggagaagttccaaaatgagattaaggacttccaaaaggattcgaagccctatttagacgctcttgggaatgatcgtatcgcttttgttagtaagaaagaccctaagcactccgcactttctaacttcaagtatacaaatgcatcgaaatctcccaacaaaggtgtgggtgtcacaaatggcgtttctcatctggaggctgggttttcaaaagtggcggtatttaatctgccaaatttaaataaccttgccattacatcagtcgtacgccgcctcgag。

8、本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法，包括以下步骤：

9、a、质粒构建，原核表达

10、将核苷酸序列如seq id no:2所示的基因连接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；

11、b、破菌、离心

12、收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；

13、c、包涵体洗涤及溶解

14、将步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行离心，并使用a液进行重悬清洗，2～8℃溶解过夜；

15、d、ni柱亲和纯化

16、a液重悬后获得的上清液，使用a液平衡层析柱，使用b液梯度洗脱，进行纯化；

17、e、凝胶过滤层析

18、经步骤d纯化的目的蛋白，使用c液平衡凝胶过滤层析柱，c液复性并洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1。

19、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法中，步骤a所述的表达载体为pet28a；宿主菌为e.coli bl21(de3)；表达条件为16～37℃，120～220rpm；诱导浓度为0.1～0.5mm iptg。

20、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法中，步骤b所述的破菌液为ph 6.0～8.0的20～50mm pb，0.1～0.5m nacl；破菌条件为外循环温度-4～0℃、压力600～850bar、功率20～30％、4～6个循环；离心条件为2000～5000g，10～30min。

21、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法中，步骤c所述的包涵体洗涤液组成为：ph 6.0～8.0的20～50mm pb，0.1～1％triton x～100，1～5mm edta，0.1～0.5m nacl。

22、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法中，步骤c所述的离心条件为12000～17000rpm，15～30min。

23、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法中，步骤d所述的ni亲和填料为ni sepharose high performance(cytiva，货号：17526802)；所述的a液组成为：ph 6.0～8.0的20～50mm pb，0.1～0.5m nacl和10～50mm咪唑，6～8m尿素；b液组成为ph6.0～8.0的20～50mm pb，0.1～0.5m nacl和0.5～1m咪唑，6～8m尿素。

24、其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1的制备方法中，步骤d所述的凝胶过滤层析柱填料为sephadex g-25medium(cytiva，货号：17003301)；所述c液组成为：ph6.0～8.0的10～30mm pb，100～150mm nacl，0.1～0.6％精氨酸。

25、本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原caga1在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。

26、进一步的，所述的药物为疫苗。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

28、本发明通过分析hp全基因组中与caga相关序列，并截取其n端包含功能结构域的基因序列进行表达纯化，获得可引起胃上皮细胞功能紊乱与病变的蛋白caga1的氨基酸序列，并对编码该氨基酸的核苷酸序列进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，将其导入载体重组表达后，得到大肠杆菌表达的基因工引起程重组幽门螺杆菌抗原蛋白caga1。

29、进一步的，本发明采用特别的蛋白纯化方法，从表达的重组单位基因工程蛋白caga1的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于95％，通过氨基酸序列预测本发明构建获得的蛋白caga1分子质量约为56.5kd，等电点在5.7左右。并验证发现该重组蛋白能够有效刺激体液免疫应答，血清抗体igg显著提高，也能有效刺激黏膜免疫应答，产生较高的抗体siga，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果，可以作为预防幽门螺杆菌感染的抗原成分使用，后续用来制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。