一种抗前列腺特异性抗原的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种抗前列腺特异性抗原的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、前列腺特异性抗原(psa)是一种分子量为30～34kd的糖蛋白，结构与腺体激肽释放酶相似。psa具有丝氨酸蛋白酶的作用。在血液中，psa与蛋白酶抑制剂如α-1-抗糜蛋白酶(act)，α-2-巨球蛋白(a2m)和其他急性期蛋白结合形成不可逆的复合体，其蛋白水解活性受抑制。除这些复合体外，约30％的psa在血液中还以游离态存在，但游离态无蛋白水解活性。

2、血清中psa水平升高通常提示前列腺存在病理状况(如前列腺炎、前列腺良性增生或前列腺癌)。由于尿道旁腺、肛腺、乳房组织或乳腺癌癌组织也会分泌psa，因此女性血清中也可能检出低水平的psa。即便是前列腺根治切除后也可能检测出psa。psa测定的主要应用领域是在前列腺癌或接受激素治疗的患者中检测疗效和疾病进展。

3、基于psa在前列腺领域的诊断、治疗和预后方面所表现出的突出特性，研发出针对前列腺特异性抗原的抗体显得尤为重要。

4、1993年，hamers-casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(h2)的抗体，其主要是igg2和igg3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(heavy chain only like antibody，hcabs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为vhh区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdab)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kda，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(nbs)。

5、纳米抗体有来源于成年骆驼体内hcabs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和ph环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在疾病的临床诊断和治疗中也具有很大的发展前景。

6、针对psa这一前列腺癌的标志物，目前国外主要有罗氏的电化学发光试剂盒和雅培、贝克曼的化学发光试剂盒，但是存在交叉污染潜在问题，且对环境因素和其它非特异性反应过于敏感，同时仪器及试剂完全依赖进口，价格非常昂贵，为患者带来一定的经济负担。国产试剂有安图生物、深圳新产业、迈瑞医疗等一系列化学发光试剂盒，由于目前采用的抗体原材料都是鼠单克隆抗体，存在亲和力不足、成本较高、灵敏度不足等缺点。现有技术中，还没有明显改善抗体亲和力和试剂盒检测灵敏度的方法。

7、鉴于此，特提出本发明，进行抗psa纳米抗体的研制及将其应用于磁微粒化学发光领域，来改善抗体亲和力和试剂盒检测灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗前列腺特异性抗原的纳米抗体及其应用以解决抗体亲和力不高、灵敏度低等技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种抗前列腺特异性抗原(psa)的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个重链可变区均包含cdr1、cdr2和cdr3：

4、(1)如seq id no.11～13所示；

5、(2)如seq id no.14～16所示；

6、(3)如seq id no.17～19所示；

7、(4)如seq id no.20～22所示；

8、和(5)如seq id no.23～25所示。

9、发明人提供了一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有优异的特异性抗原结合能力，又能克服传统抗体亲和力不足等固有缺陷的抗psa的纳米抗体。该纳米抗体的提出可以用于制备前列腺特异性抗原检测试剂盒，尤其是应用于磁微粒化学发光领域，用于制备磁微粒化学发光试剂盒以及前列腺癌诊断试剂盒。

10、上述5种抗psa的纳米抗体均能特异性结合psa抗原，可应用于前列腺特异性抗原的检测、富集、纯化、前列腺癌的检测和诊断。

11、在本发明应用较佳的实施方式中，纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。

12、在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。

13、名词解释：

14、单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。

15、多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。

16、融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如bsa、igg-fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体vhh和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。

17、在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示。

18、第二方面，本发明还提供了一种抗体，其含有上述的抗前列腺特异性抗原的纳米抗体或包括上述的抗前列腺特异性抗原的纳米抗体的重链可变区。

19、在一些实施例中，抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。抗原结合片段包括所述抗原结合片段选自抗体的f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。

20、本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。

21、上述抗原结合片段也即抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

22、上述抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

23、第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗前列腺特异性抗原的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体。

24、在一种可选的实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。

25、考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

26、重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的dna片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。

27、其中一种类型的载体是质粒，即环状双链dna分子，可将目的dna片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的dna片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。

28、第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。

29、宿主细胞例如选自哺乳动物细胞，哺乳动物细胞选自293细胞、293t细胞、293ft细胞、cho细胞、cos细胞、小鼠l细胞、lncap细胞、633细胞、vero、bhk细胞、cv1细胞、hela细胞、mdck细胞、hep-2细胞和per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、per6细胞和cho细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。

30、第五方面，本发明还提供了一种抗前列腺特异性抗原的纳米抗体或抗体在制备前列腺特异性抗原检测产品、前列腺特异性抗原富集产品或纯化产品中的应用。

31、基于上述5种纳米抗体具有与前列腺特异性抗原较高的亲和力，因此，可以用于前列腺特异性抗原的检测、前列腺特异性抗原的富集或纯化。

32、在一种可选的实施方式中，检测产品选自试剂、试剂盒或芯片。

33、在一种可选的实施方式中，试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒。例如基于双抗体夹心法的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括检测抗体和捕获抗体。

34、在一种可选的实施方式中，前列腺特异性抗原富集产品或纯化产品包括载体以及载体上的纳米抗体或抗体；

35、在一种可选的实施方式中，载体选自磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。

36、第六方面，本发明还提供了一种包被有上述的抗前列腺特异性抗原的纳米抗体或抗体的纳米颗粒，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒中的任意一种。

37、例如抗前列腺特异性抗原的纳米抗体或抗体的纳米颗粒为磁性纳米颗粒。

38、第七方面，本发明还提供了一种前列腺特异性抗原检测试剂盒，其包括：抗前列腺特异性抗原的纳米抗体或抗体。

39、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中的纳米抗体或抗体标记有可被检测的标记物，和/或试剂盒包括纳米颗粒，且纳米颗粒包被有纳米抗体或抗体。

40、在一种实施方式中，包被有纳米抗体或抗体的纳米颗粒作为捕获抗体，标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体作为检测抗体。

41、在另外一种实施方式中，当试剂盒仅包括：标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体；此时的纳米抗体或抗体可用于捕获或检测抗体。

42、在一种可选的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。

43、荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。

44、在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

45、在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212bi、131i、111in、90y、186re、211at、125i、188re、153sm、213bi、32p、94mtc、99mtc、203pb、67ga、68ga、43sc、47sc、110min、97ru、62cu、64cu、67cu、68cu、86y、88y、121sn、161tb、166ho、105rh、177lu、172lu和18f。

46、在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱和过氧草酸盐中的至少一种。

47、胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

48、在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

49、在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

50、在一种可选的实施方式中，以seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq idno.9或seq id no.10所示的纳米抗体为捕获抗体。

51、在一种可选的实施方式中，以seq id no.6所示的纳米抗体为捕获抗体，以seq idno.8或seq id no.10所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体包被于磁性纳米颗粒上，检测抗体上标记有标记物。

52、seq id no.6所示的纳米抗体与seq id no.8或seq id no.10所示的纳米抗体分别针对psa抗原不同的抗原表位，可以结合不同的抗原表位并扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度，通过双抗夹心的方法，可以快速准确地完成psa的捕获和检测。由此，组成的捕获-检测抗体对可以增大检测和诊断的效率。此外，本发明提供的检测试剂盒与罗氏psa诊断试剂盒的检测值相关性较好，精密度在4％以下，性能良好。

53、在一种可选的实施方式中，以seq id no.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以seq idno.6所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体包被于磁性纳米颗粒上，检测抗体上标记有标记物。

54、在一种可选的实施方式中，以seq id no.10所示的纳米抗体为捕获抗体，以seqid no.6所示的纳米抗体为检测抗体，捕获抗体包被于磁性纳米颗粒上，检测抗体上标记有标记物。

55、第八方面，本发明还提供了抗前列腺特异性抗原的纳米抗体或抗体在制备前列腺癌检测或诊断产品中的应用，前列腺癌的诊断标志物为前列腺特异性抗原。

56、磁微粒化学发光技术是将免疫磁珠体系、化学发光体系与免疫反应体系相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。它既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫操作的简便、快速特点，易于自动化操作，在测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，广泛应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作。本发明提供的抗psa的纳米抗体能够通过磁微粒化学发光等技术用于前列腺癌诊断。

57、本发明具有以下有益效果：

58、本发明提供了一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有优异的特异性抗原结合能力，又能克服传统抗体亲和力不足等固有缺陷的抗psa的纳米抗体。该纳米抗体的提出可以用于制备前列腺特异性抗原检测试剂盒，尤其是应用于磁微粒化学发光领域，用于制备磁微粒化学发光试剂盒以及前列腺癌诊断试剂盒。

59、本发明提供的5种抗psa的纳米抗体均能特异性结合psa抗原，可应用于前列腺特异性抗原的检测、富集、纯化、前列腺癌的检测和诊断。

60、本发明提供的检测试剂盒与罗氏psa诊断试剂盒的检测值相关性较好，精密度在4％以下，性能良好，具有良好的应用前景。