单倍体诱导基因的应用

本发明属于植物育种领域，具体涉及一种与玉米单倍体诱导有关的基因。本发明提供了该基因的核酸和氨基酸序列以及利用基因编辑方法编辑基因序列，创制单倍体诱导系的方法，同时公开了创制获得的单倍体诱导系的编辑后基因序列。

背景技术：

1、单倍体在植物遗传育种中具有重要意义。单倍体育种一般只需要两年就能获得纯合的自交系，比常规方法缩短育种周期3-5年。同时，单倍体育种的选择效率更高，且有利于准确筛选隐性突变体。此外，单倍体技术还广泛应用于自交系的提纯复壮、遗传材料的创制以及作物数量遗传的应用研究等领域。

2、在单倍体育种领域，玉米单倍体育种技术的应用最为成功，这主要得益于天然玉米高频单倍体诱导系stock 6等的应用。当stock 6做父本时，可以形成只保留母本基因组的单倍体，结合r1-nj颜色标记，单倍体的选择效率大大提高。通过数十年的遗传改良，诱导率在10-12％的诱导系已经非常常见(dong x,xu x,miao j,et al.fine mapping ofqhir1 influencing in vivo haploid induction in maize[j].theoretical&appliedgenetics,2013,126(7):1713-1720.)。通过单倍体诱导系诱导获得dh纯系是目前玉米常规育种工作中最有经济意义的方法，美国是玉米单倍体诱导系育种的发源地，目前国外大约60％的马齿型自交系及30％的硬粒型自交系都由单倍体技术选育而来的(徐艳霞.stock6在玉米自交系选育中的应用[j].黑龙江农业科学，2014，(11)：157-159.)。因此，单倍体诱导系的应用与发展在农作物遗传育种中具有重大意义。然而，具有天然诱导系功能的种质资源有限，通过传统育种培育诱导系也十分困难。另外，在玉米之外的作物上，由于没有类似stock 6这样的天然诱导系，人工培育诱导系更加困难。

3、研究证实，单倍体诱导系stock 6的诱导能力是受多个数量性状位点控制的遗传性状，其中两个主效qtl qhir1和qhir8，分别可以解释66％和20％的表型变异(prigge v,xu x,li l,et al.new insights into the genetics of in vivo induction ofmaternal haploids,the backbone of doubled haploid technology in maize[j].genetics,2012,190(2):781-93.)。其中qhir8位点被精细定位在789kb的区间内(liu c,li w,zhong y,et al.fine mapping of qhir8 affecting in vivo haploid inductionin maize[j].theoretical and applied genetics,2015,128(12):2507-2515.)；qhir1位点也已经被精细定位和克隆，并明确了控制该位点的功能基因为zmpla1/matl/nld(liu c,li x,meng d,et al.a4-bp insertion at zmpla1 encoding a putative phospholipasea generates haploid induction in maize[j].mol plant,2017,10(3):520-522；kelliher t,starr d,richbourg l,etal.matrilineal,a sperm-specificphospholipase,triggers maize haploid induction[j].nature,2017,542(7639):105-109；gilles l m,khaled a,laffaire,j b,et al.loss of pollen-specificphospholipase not like dad triggers gynogenesis in maize[j].the embo journal,2017,36(6):707-717.)。zmpla1/matl/nld基因编码一种磷脂酶，突变失活后能够造成精细胞dna断裂，从而产生只含有母本基因组的单倍体。人工突变zmpla1/matl/nld基因可以人工创制单倍体诱导系。然而zmpla1在双子叶植物中没有直系同源基因，这也暗示pla1突变的单倍体诱导技术可能难以应用于双子叶作物。

4、因此，为了进一步拓宽单倍体诱导系的创制途径，更多的与单倍体诱导有关的基因亟待鉴定。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于公开一种与玉米单倍体诱导有关的蛋白和核酸序列。

2、本发明的目的之二在于提供一种玉米单倍体诱导系的人工创制方法。

3、本发明的目的之三在于提供一种玉米单倍体诱导系的人工突变基因。

4、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

5、本发明提供一种蛋白质在创制玉米单倍体诱导系中的应用，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.1-seq id no.3任意一个所示。其中seq id no.1-seq idno.3分别代表zmpod65、zmpod60-1、zmpod60-2蛋白序列。

6、本发明还提供一种核酸在创制玉米单倍体诱导系中的应用，其特征在于：所述核酸编码上述的蛋白。

7、在一些实施方案中，上述核酸的序列如seq id no.4-seq id no.9任意一个所示。其中seq id no.4-seq id no.6是b73中的zmpod65、zmpod60-1、zmpod60-2基因序列，seqid no.7-seq id no.9是kn5585中的zmpod65、zmpod60-1、zmpod60-2基因序列，两个材料中的基因序列有个别碱基的差异，但编码的蛋白序列是一样的。

8、本发明还提供一种创制玉米单倍体诱导系的方法，其特征在于：抑制玉米中上述蛋白的表达和/或活性和/或磷酸化修饰水平，选择可以诱导玉米单倍体的植株。由于蛋白的磷酸修饰水平会影响过氧化物酶的生化活性，3个蛋白的磷酸化水平在单倍体诱导材料中发生了变化，会导致自身蛋白酶活性的降低，进而导致花粉内的ros含量上升，使得精细胞的dna受到破坏并降解，最终诱导了单倍体的产生。因此，抑制玉米中上述蛋白的表达、活性、磷酸化均可以创制出新的单倍体诱导材料。

9、在一些实施方案中，上述创制玉米单倍体诱导系的方法包括基因编辑、rna干扰、t-dna插入中任一种。

10、在一些实施方案中，上述基因编辑采用crispr/cas9方法。

11、在一些实施方案中，上述crispr/cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的dna序列如seq id no.10所示；或seq id no.11和seq id no.12所示的组合；或seq id no.20所示；或seq id no.24和seq id no.25所示的组合。

12、本发明还提供一种用于创制玉米单倍体诱导系的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

13、(1)能够识别上述靶标序列的rna分子；该rna分子可以是包含grna、crrnas和tracrrna结构的sgrna分子，也可以是grna、crrnas和tracrrna单独形成的复合体，或包括grna、crrnas的复合体；在一些实施方案中，这些rna分子的序列如seq id no.13所示；或seq id no.14和seq id no.15所示的组合；或seq id no.21所示；或seq id no.26和seqid no.27所示的组合；

14、(2)编码(1)所述sgrna的dna分子；

15、(3)表达(1)所述sgrna的载体。

16、本发明还提供一种玉米单倍体诱导系突变基因和突变蛋白，其特征在于：所述突变基因序列为seq id no.16或seq id no.17或seq id no.22或seq id no.28所示；所述突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.18或seq id no.19或seq id no.23或seq id no.29所示。这些突变基因或突变蛋白可以通过常规杂交授粉的方式转育到其他玉米材料或玉米品种中，从而培育新的单倍体诱导系。

17、本发明的优点及有益效果如下：本发明通过将野生型与单倍体诱导系材料的多组学数据进行整合分析，从183个过氧化物酶基因中，逐步筛选到在配子体发育时期分子层面存在差异，会影响ros含量，进而可能导致单倍体诱导的3个功能基因grmzm2g442008、grmzm2g122816和grmzm2g063435，并进一步验证了这3个基因的单倍体诱导功能。之前的技术资料并未给出这3个基因与玉米单倍体诱导相关的技术启示。本发明提供了新的单倍体诱导相关基因及蛋白，并提供了创制单倍体诱导系的新方法，同时公开了创制获得的单倍体诱导系的编辑后基因序列。