多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用

本发明属于食管鳞癌标志物，具体涉及一种多肽circ1946-109aa、该多肽的融合蛋白、包含circ1946-109aa的药物组合物及所述多肽作为食管鳞癌预后标志物、免疫检查点调节剂的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、食道鳞癌是病理类型为鳞状细胞的恶性肿瘤，属于消化系统常见的恶性肿瘤之一，占食道癌发病人群的90％。食道鳞癌最常见的临床症状是进行性加重的吞咽困难，并且随着病情的进展，患者还会出现转移灶的相关临床症状，严重时会威及生命。目前针对食管鳞癌发生发展的分子机制研究相对滞后，尚无有效的筛查方法。

3、circrna具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征，现有研究证实了circrna在生物的生长发育、胁迫应答、疾病的发生发展方面密切相关，circrna作为在食管鳞癌的标志物已具有相关报道。目前对circrna生物学功能仍存在较大未知部分，通常认为circrna可能通过mirna"海绵"、调控rna结合蛋白或rna聚合酶的方式调控蛋白转录。随着circrna编码潜能的验证和功能的探究，部分circrna编码产物也被证实发挥了一定的生理活性。目前，可编码circrna及其编码产物在胶质瘤等肿瘤中的作用已有初步探索，circrna编码产物可干扰肿瘤细胞的增殖、转移等生物学行为，影响肿瘤的发生发展。然而，来自于circrna的编码产物在食管鳞癌中的作用尚未有文献报道。

4、b7-h3，又称cd276，是一个重要的免疫检查点，可使肿瘤细胞免受人体t细胞的攻击和杀伤作用，已成为免疫治疗的新型靶点，但其在食管鳞癌中的作用有待进一步研究。另外，以往研究重点关注b7-h3的t细胞抑制功能及下游调节机制，b7-h3的上游调节机制这一层面上的工作在国内外都相对匮乏。

技术实现思路

1、本发明研究发现，hsa_circ_0001946能够编码得到一段长度为109aa的多肽序列，本发明通过质谱检测、western blot、核糖体关联分析等实验方法验证了其真实存在。由于hsa_circ_0001946与免疫检查点分子b7-h3表达相关，本发明针对上述多肽与b7-h3的相关性进行研究，证实了该多肽能够降低b7-h3在rna水平的表达从而调控食管鳞癌免疫逃逸，另一方面，通过细胞划痕、transwell实验发现，过表达上述多肽有利于抑制食管鳞癌的转移，可作为潜在的治疗靶点。

2、基于上述研究成果，本发明提供如下的技术方案：

3、第一方面，提供具有如下序列的多肽：

4、(1)具有如seq id no:1所示氨基酸序列的多肽；

5、(2)与seq id no:1所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与上述多肽仍具有相同或基本相同的功能。

6、在本发明验证的一种实施方式中，hsa_circ_0001946编码的多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示，命名为circ1946-109aa；经验证，circ1946-109aa在食管鳞癌患者中为低表达，可作为食管鳞癌的预后标志物。进一步的，本发明还发现，circ1946-109aa能够抑制免疫检查点b7-h3的表达。b7-h3表达于癌细胞和骨髓细胞，包括t细胞和b细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞，作为共刺激/共抑制免疫检查点分子具有双重作用，与肿瘤的生长、转移、复发和预后不良密切相关。上述发现提供了circ1946-109aa作为肿瘤免疫点抑制剂及食管鳞癌治疗活性成分的应用。

7、上述(2)方面中，所述一个或多个可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个，所述添加、缺失或替换可以发生在seq id no:1所示氨基酸序列的n-末端和/或c-末端或序列中；进一步的，所述衍生多肽的序列与seq id no:1所示氨基酸序列具有90％及以上的相似性；更进一步的，所述相似性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；所述氨基酸序列的相似性可采用本领域常用方式进行比对，例如blast方法。所述衍生多肽与circ1946-109aa仍具有相同或基本相同的功能，所述功能主要包括抑制b7-h3表达、调控食管鳞癌免疫逃逸、抑制食管鳞癌转移等功能。

8、另外，上述衍生多肽还广泛的包括circ1946-109aa经过化学或遗传修饰后形成的多肽产品；本领域常见的修饰方式包括链霉亲和素、各种分子(例如生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂等)修饰等；还包括circ1946-109aa的固定化产品，如采用物理吸附、载体、树脂交联材料等对上述多肽进行固定或修饰的产品。

9、第二方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一方面所示的多肽，还包括其他效应片段。

10、所述其他效应片段可能发挥的功效如延长体内半衰期、改善溶解性或提高透过生物屏障的能力；

11、进一步的，用于延长体内半衰期的片段为包括但不限于血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的单域抗体)、聚乙二醇-脂质体复合体中的一种。

12、进一步的，所述提高透过生物屏障能力的效应片段如穿膜肽，本领域常见的穿膜肽如为h7r8、hiv-i tat(48-60)、tat(47-57)、tat(48-57)、r9-tat中的一种。

13、其他优选的方案中，所述多肽与效应片段之间还具有连接肽，所述连接肽为丙氨酸(a)和/或丝氨酸(s)和/或甘氨酸(g)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，进一步优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个等。

14、第三方面，提供编码第一方面所述多肽、第二方面所述融合蛋白的核酸物质。

15、考虑到密码子简并性等因素，除hsa_circ_0001946外，所述核酸物质为任意能够翻译得到上述多肽及融合蛋白的编码核酸，包括dna形式及rna形式，其中，dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna，可以是单链的或是双链的，可以是编码链或非编码链。分离所述核酸物质的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，通过自动dna合成和/或重组dna技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。

16、第四方面，提供包括第三方面所述核酸物质的构建体。

17、所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说是常规的，例如，通过体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

18、第五方面，提供一种药物组合物，所述组合物中包括第一方面所述多肽或第二方面所述融合蛋白，还包括药学上可接受的赋形剂。

19、所述药学上可接受的赋形剂，其剂量对于受试者而言应当是无害的，具体的种类可以是：缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、亲水性聚合物、碳水化合物、螯合剂、张力调节剂、表面活性剂、成盐抗衡离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。

20、第六方面，提供第一方面所述多肽作为食管鳞癌免疫检查点调节剂的应用。

21、上述应用的具体形式包括但不限于如下形式：

22、(1)circ1946-109aa的检测试剂在制备食管鳞癌预后判断产品中的应用；

23、(2)第一方面所述多肽、第二方面所述融合蛋白或第五方面所述药物组合物在制备b7-h3过表达疾病治疗药物中的应用；

24、(3)一种食管鳞癌的治疗方法，所述治疗方法包括向有治疗需求的对象施用治疗剂量的第一方面所述多肽、第二方面所述融合蛋白或第五方面所述药物组合物。

25、上述(1)方面中，所述食管鳞癌预后判断产品的种类包括试剂及器械，一种具体的实例如，试剂盒。

26、上述(2)方面中，所述b7-h3过表达疾病为肿瘤，为包括但不限于黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、消化道癌中的一种，本发明验证的一种实例如，食管鳞癌。

27、以上一个或多个技术方案的有益效果在于：

28、目前，本领域对于circrna编码功能的研究仍较为空白，circrna编码产物与circrna活性的关联性还存在许多未知的部分，circrna编码产物的鉴定仍较为困难。本发明验证首先证实了hsa_circ_0001946能够编码新型蛋白circ1946-109aa，该研究成果仍具有较高的创新性。上述发现进一步丰富了circrna编码功能及疾病调控作用的研究资料，提供了一种可行的食道鳞癌治疗活性成分，具有重要的应用前景。