一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的方法

本发明涉及一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的方法，属于生物酶。

背景技术：

1、阿魏酸酯酶(e.c.3.1.1.73，ferulicacid esterases，fae)又称肉桂酸酯酶，它是一种羧酸酯酶，具体是指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的酶。阿魏酸在植物细胞壁结构中起着重要的作用，它可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。阿魏酸酯酶能切断细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，因此在食品、饲料和造纸工业中具有广阔的应用前景。在食品工业中可利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚糖(主要是低聚木糖)、阿魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效率。

2、阿魏酸酯酶的多种生物技术功能，致使其在工业生产中具有极大的利用潜力。但是在现有研究中，阿魏酸酯酶的生产多是从各种微生物中分离和纯化。如中国专利文献cn110066757a(申请号201910312493.5)公开了一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌，该菌株能分泌阿魏酸酯酶，在麸皮诱导下，其发酵粗酶液的阿魏酸酯酶酶活为116u/l，且以麦麸为底物发酵生产阿魏酸，产量可达59.51±0.6mg/l。因此，开发其他提高阿魏酸酯酶产量的途径和方法仍然有其必要性。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的方法。本发明使用大肠杆菌这一经典的原核基因表达宿主将噬淀粉乳杆菌来源的阿魏酸酯酶faelam异源表达，前期研究发现，在大肠杆菌中异源表达时，阿魏酸酯酶faelam可以稳定表达并分泌至大肠杆菌胞外。在此基础上，使用大肠杆菌密码子偏好性优化、级联t7启动子及更换5’utr等方法，使得阿魏酸酯酶的表达量与胞外分泌量显著提高，从而为阿魏酸酯酶的生产提供新的生产菌株与生产方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的方法，是在阿魏酸酯酶编码基因起始端级联2～4个t7启动子。

4、根据本发明优选的，是在阿魏酸酯酶编码基因起始端级联4个t7启动子。

5、根据本发明优选的，所述阿魏酸酯酶是来源于噬淀粉乳杆菌cgmcc no.11056的阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、根据本发明优选的，所述阿魏酸酯酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、根据本发明优选的，所述阿魏酸酯酶的表达宿主为大肠杆菌。

8、本发明一种优选的技术方案，一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的具体方法，包括如下步骤：

9、(1)以含有阿魏酸酯酶编码基因的质粒pet22b-opt-fae为模板，反向pcr扩增得到不包含t7启动子序列的载体片段t7-re，再通过pcr扩增得到包含阿魏酸酯酶编码基因同源臂序列的级联2～4个t7启动子的片段t7×2～4，将t7-re片段与t7×2～4片段连接，构建得到在阿魏酸酯酶编码基因起始端级联2～4个t7启动子的重组质粒pet22b-t7×2～4-opt-fae；所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.3所示；

10、(2)将步骤(1)构建的重组质粒pet22b-t7×2～4-opt-fae转化至e.coli bl21中，构建重组菌株；

11、(3)将步骤(2)构建的重组菌株进行诱导表达。

12、一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的方法，将阿魏酸酯酶编码基因起始密码子上游的原始5’utr序列替换为utr-a、utr-b或utr-c，所述原始5’utr序列的核苷酸序列如seq idno.4所示，所述utr-a的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述utr-b的核苷酸序列如seq idno.6所示，所述utr-c的核苷酸序列如seq id no.7所示。

13、根据本发明优选的，所述阿魏酸酯酶是来源于噬淀粉乳杆菌cgmcc no.11056的阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

14、根据本发明优选的，所述阿魏酸酯酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

15、根据本发明优选的，所述阿魏酸酯酶的表达宿主为大肠杆菌。

16、本发明一种优选的技术方案，一种提高阿魏酸酯酶表达分泌量的具体方法，包括如下步骤：

17、(a)以含有阿魏酸酯酶编码基因的质粒pet22b-opt-fae为模板，反向pcr扩增得到不包含原始5’utr序列和阿魏酸酯酶编码基因序列的utr-re片段，再通过pcr扩增得到包含utr-a、utr-b或utr-c序列与阿魏酸酯酶编码基因序列的utr-opt-fae片段，将utr-re片段与utr-opt-fae片段连接，构建得到原始5’utr序列替换为utr-a、utr-b或utr-c的重组质粒；所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.3所示；

18、(b)将步骤(a)构建的重组质粒转化至e.coli bl21中，构建重组菌株；

19、(c)将步骤(b)构建的重组菌株进行诱导表达。

20、根据本发明优选的，步骤(a)中通过pcr扩增得到包含utr-a、utr-b或utr-c序列与阿魏酸酯酶编码基因序列的utr-opt-fae片段时，使用的上游引物序列中含有utr-a、utr-b或utr-c的序列片段。

21、有益效果：

22、1、启动子是用于实现合成各种生物学目标的最重要和最基本的工具之一，是基因表达的第一个开关，可以在转录阶段直接决定细胞内的mrna浓度。具有t7启动子的pet表达系统是目前研究中使用最广泛的大肠杆菌异源表达系统。由于t7启动子活性强，重组蛋白可积累至细胞总蛋白的50％，而且t7 rna聚合酶对其自身的启动子具有高度选择性。所以通过提高级联t7启动子的数量，提高t7 rna聚合酶的结合效率，达到提高转录和翻译表达能力，在优化大肠杆菌复杂代谢网络与生产有价值产物等方面具有很大的研究潜力。本发明通过级联4个t7启动子，使得阿魏酸酯酶的胞外蛋白产量达到了3901.19u/l，相比于重组菌株e.coli bl21/pet22b-opt-fae提高了36.46％。

23、2、起始密码子上游的5’utr(5’端非编码区)也与翻译起始和蛋白质表达密切相关。5’utr的结构特征在控制翻译效率方面也起着重要作用，因为蛋白质表达是通过核糖体与5’utr中的shine-dalgarno(sd)序列结合引发的。sd序列和起始密码子之间的距离和核苷酸序列，都会对翻译效率和蛋白质产生显著影响。本发明通过更换5’utr，使得阿魏酸酯酶的胞外蛋白产量最高达到3752.24u/l，相比e.coli bl21/pet22b-opt-fae提高了31.25％。