CD22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体的制作方法

本发明涉及cd22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体，更详细地，涉及与cd22特异性结合的人源化抗体、包含上述抗体或cd19xcd22抗体的嵌合抗原受体、表达上述嵌合抗原受体的嵌合抗原受体t(car-t)细胞及包含它们的用于预防或治疗由b细胞介导的疾病的药学组合物。

背景技术：

1、cd22在包括非霍金斯淋巴瘤(non-hogkins lymphoma，nhl)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukaemia，b-all)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocyticleukaemia，b-cll)及尤其急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphocytic leukaemia，anll)的大部分的b细胞白血病及淋巴瘤中表达。

2、为了治疗或诊断这种与cd22表达相关的疾病等，正在研发cd22特异性抗体。在国际公开专利wo 1998-041641号中公开了在vh44及vl100位具有半胱氨酸残基的重组抗cd22抗体，在国际公开专利wo 1998-042378号中公开了用于治疗b细胞恶性肿瘤的抗cd22抗体。

3、如上所述，为了生产用于治疗的抗体，主要利用小鼠来生产单克隆抗体(monoclonal antibody)。但是，如源自小鼠的单克隆抗体的非人抗体在人体内被视为外来抗原，因此，诱发免疫反应，半衰期短，从而具有治疗效果有限的问题。

4、为了解决上述问题，研发了利用人抗体取代仅除与抗体的抗原结合的位点之外的剩余位点的人源化抗体。目前使用的利用人源化抗体取代小鼠抗体的方法如下：选择与所要取代的抗体最相似的人抗体基因，通过称为互补决定区(complementarity determiningregion，cdr)移植的方法仅将小鼠抗体的互补决定区位点取代为人抗体互补决定区位置。如上所述的人源化抗体将大部分的基因人源化，因此具有可减少人体内的免疫反应的优点。

5、另外，为了治疗b细胞疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应等，正在研发上述各种b细胞表面标志物(抗原)特异性抗体，除cd22抗原之外，cd19为最常用作靶等的抗原，还进行靶向其的嵌合抗原受体t细胞的许多临床研究。但是，根据不表达cd19的白血病等细胞，靶抗原表达量具有差异，仅靶向一种抗原的单一嵌合抗原受体或单一嵌合抗原受体t细胞治疗可发生因肿瘤细胞的免疫逃避战略而损失靶抗原等的问题。实际上，在b细胞all(acute lymphocytic leukemia，急性淋巴细胞白血病)患者的情况下，观察到了不表达cd19的cd19阴性复发(初对cd19嵌合抗原受体t疗法反应的b细胞all患者的最大25％)，该现象被证实为对于嵌合抗原受体t细胞治疗的肿瘤细胞的耐药性机制(maude,s.l.,etal.,n.engl.j.med.,378:439-448,2018)。

6、为了解决这个问题，正在研发靶向双抗原或多抗原的嵌合抗原受体t细胞，若同时靶向两种抗原，则可减少抗原损失变异体的可能性。

7、因此，在本发明中，为了在人体内减少免疫反应，筛选与cd22结合的抗体，利用其来制备了人源化抗cd22抗体，利用本发明的人源化抗cd22抗体来制备了靶向cd22的嵌合抗原受体及嵌合抗原受体t细胞。

8、进而，制备了靶向cd22及cd19的双特异性嵌合抗原受体(bivalent car或bispecific car)及双特异性嵌合抗原受体t细胞，确认了嵌合抗原受体在本发明中制备的cd22嵌合抗原受体t细胞及双特异性cd19xcd22嵌合抗原受体t细胞正常表达，从而完成了本发明。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的目的在于，提供cd22特异性人源化抗体、编码上述抗体的多核苷酸、表达上述抗体的载体、利用上述载体转化的重组细胞。

3、本发明的再一目的在于，提供包含上述cd22特异性人源化抗体的嵌合抗原受体、编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸、包含上述多核苷酸的载体以及包含上述多核苷酸或载体的表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞。

4、本发明的另一目的在于，提供包含cd19及cd22特异性抗体的双特异性嵌合抗原受体、编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸、包含上述多核苷酸的载体以及包含上述多核苷酸或载体的表达双特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。

5、本发明的还有一目的在于，提供包含上述免疫效应细胞的用于预防或治疗由b细胞介导的疾病的药学组合物。

6、技术方案

7、为了实现如上所述的目的，本发明提供与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段，其包括：由seq id no:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由seq id no:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者由seq id no:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由seq idno:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。

8、并且，本发明提供多核苷酸，其编码上述与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段。

9、并且，本发明提供载体，其包含编码上述与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段的多核苷酸。

10、并且，本发明提供重组细胞，其生产利用上述载体转化的与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段。

11、为了实现再一目的，本发明提供靶向cd22的嵌合抗原受体，为包含cd22结合域、跨膜结构域(transmembrane domain)、共刺激域(costimulatory domain)以及细胞内信号转导结构域(intracellular signal transduction domain)的嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，car)，其特征在于，上述cd22结合域为与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段，上述与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段包括：由seq id no:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由seq id no:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者由seq idno:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由seq id no:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。

12、在本发明的一优选实施例中，上述跨膜结构域为选自由cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152及pd1组成的组中的蛋白质，共刺激域为选自由cd28、4-1bb、ox-40及icos组成的组中的蛋白质，上述信号转导结构域可源自cd3ζ。

13、在本发明的再一优选实施例中，本发明还可包含位于上述cd22结合域的c末端与跨膜结构域的n末端之间的铰链区(hinge region)，上述铰链区可源自cd8α。

14、并且，本发明提供多核苷酸，其编码上述嵌合抗原受体。

15、并且，本发明提供载体，其包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸。

16、并且，本发明提供免疫效应细胞，其包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸或者包含上述多核苷酸的载体，并表达上述嵌合抗原受体。

17、为了实现另一目的，本发明提供靶向cd19及cd22的双特异性嵌合抗原受体，为包含cd19结合域及cd22结合域、跨膜结构域、共刺激域以及细胞内信号转导结构域的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，上述cd22结合域为与cd22特异性结合的抗体或其片段，上述与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段包括：重链可变区，包含由seq id no:1的氨基酸表示的cdr1区、由seq id no:2的氨基酸表示的cdr2区及由seq id no:3的氨基酸表示的cdr3区；以及轻链可变区，由seq id no:4的氨基酸表示的cdr1区、由seq id no:5的氨基酸表示的cdr2区及由seq id no:6的氨基酸表示的cdr3区。

18、在本发明的一优选实施例中，上述cd19结合域与cd22结合域能够以与cd19特异性结合的抗体的轻链可变区-与cd22特异性结合的抗体的重链可变区-与cd22特异性结合的抗体的轻链可变区-与cd19特异性结合的抗体的重链可变区的顺序连接。

19、在本发明的再一优选实施例中，上述与cd19特异性结合的抗体的轻链可变区可包含由seq id no:44的氨基酸表示的cdr1区、由seq id no:45的氨基酸表示的cdr2区以及由seq id no:46的氨基酸表示的cdr3区，优选地，可由seq id no:48的氨基酸序列表示。

20、在本发明的另一优选实施例中，上述与cd19特异性结合的抗体的重链可变区可包含由seq id no:41的氨基酸表示的cdr1区、由seq id no:42的氨基酸表示的cdr2区及由seq id no:43的氨基酸表示的cdr3区，优选地，可由seq id no:47的氨基酸序列表示。

21、在本发明的还有一实施例中，上述跨膜结构域为选自由cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152及pd1组成的组中的蛋白质，共刺激域为选自由cd28、4-1bb、ox-40及icos组成的组中的蛋白质，上述信号转导结构域可源自cd3ζ。

22、在本发明的又一实施例中，本发明还可包含位于上述cd22结合域的c末端与跨膜结构域的n末端之间的铰链区，上述铰链区可源自cd8α。

23、并且，本发明提供多核苷酸，其编码上述双特异性嵌合抗原受体。

24、并且，本发明提供载体，其包含编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸。

25、并且，本发明提供免疫效应细胞，其包含编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸或者包含上述多核苷酸的载体，并表达上述双特异性嵌合抗原受体。

26、为了实现还有一目的，本发明提供用于预防或治疗由b细胞介导的疾病的药学组合物，其包含：上述与cd22特异性结合的人源化抗体或其片段；或者上述免疫效应细胞。

27、在本发明的一优选实施例中，由b细胞介导的疾病可选自由肿瘤、淋巴瘤、非霍金斯淋巴瘤(non-hogkins lymphoma，nhl)、侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性延迟性非霍金斯淋巴瘤、难治性非霍金斯淋巴瘤、难治性延迟性非霍金斯淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cll)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(hairy cell leukemia，hcl)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，all)、伯基特淋巴瘤及套细胞淋巴瘤组成的组中。

28、发明的效果

29、在本发明中，制备了与cd22特异性结合的人源化抗体，利用其来制备了靶向cd22的单一嵌合抗原受体t细胞及靶向cd19及cd22的双特异性嵌合抗原受体t细胞。

30、确认了在本发明中制备的cd22嵌合抗原受体t细胞及双特异性cd19xcd22嵌合抗原受体t细胞有效识别cd22抗原来使嵌合抗原受体t细胞活化，并确认了有效杀死表达cd22的细胞。

31、进而，确认了双特异性cd19xcd22嵌合抗原受体t细胞在动物模型中显示出优秀的抗肿瘤效果，可将本发明的基于与cd22特异性结合的人源化抗体的cd22嵌合抗原受体t细胞及双特异性cd19xcd22嵌合抗原受体t细胞有用地用作用于预防或治疗与cd22(或cd19)表达相关的疾病或与b细胞相关的疾病的组合物。