本发明涉及生物医药，具体地，本发明涉及能够特异性识别cd24的人源化抗体及其应用。
背景技术：
：：1、cd24，分化簇24(cluster of differentiation 24)是一种小的、高度糖基化的细胞粘附蛋白，也被称为热稳定抗原(heat-stable antigen，hsa)。cd24分子是表观分子量介于30～70kda之间的高度糖基化唾液酸糖蛋白。cd24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的o-或n-糖基化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，gpi)锚定在细胞膜的表面。在生理情况下，cd24分子仅在未成熟b细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达；而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著高水平表达的cd24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。最新研究表明，cd24作为一个新的免疫检查点抑制剂，能够与巨噬细胞表面表达的抑制性受体siglec—10结合，通过相互作用产生“别吃我”的信号。该抑制性信号抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，并引发免疫抑制信号级联反应，限制巨噬细胞的吞噬作，从而使得肿瘤细胞逃避巨噬细胞的免疫监视。且据报道，通过抗体阻断cd24-siglec 10相互作用经巨噬细胞引起肿瘤生长减少，并且延长了卵巢癌及乳腺癌荷瘤小鼠的生存期。2、p选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，cd24是其配体之一。cd24分子高表达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为细胞膜表面信号转导分子，cd24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移和侵袭。3、近年来，大量的文献表明cd24在多种恶性肿瘤和肿瘤干细胞中高度表达，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肝癌、膀胱癌、以及b细胞淋巴瘤等。研究表明，cd24是许多类型肿瘤的潜在预后标志物，例如在前列腺癌中，检测cd24的表达水平有助于确定患者复发风险等级；在结直肠癌和非小细胞肺癌中，cd24的表达水平能作为患者生存的独立预后标志物；在膀胱癌中，cd24表达的上调参与了更具有侵袭性的癌症发生过程和肿瘤的复发。此外，cd24被认为是卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌以及鼻咽癌中重要的肿瘤干细胞标志物之一，其过度表达可诱导肿瘤干细胞的维持和激活。4、因此，尽管针对cd24靶点的各项疗法已取得初步发展，但本领域仍迫切需要开发新型的cd24单克隆抗体作为巨噬细胞检查点抑制剂发挥抗肿瘤免疫作用。技术实现思路1、申请人前期不仅成功获得了一种新型的具有抗肿瘤作用的抗人cd24单克隆抗体，更重要的是，申请人将获得的鼠源抗人cd24的单克隆抗体经人源化改造成了人源化单克隆抗体。具体地，将鼠源抗cd24单克隆抗体的fr区和恒定区替换为人源的，保留鼠源抗cd24单克隆抗体可变区的cdr，得到了一系列的抗cd24的人源化单克隆抗体。且申请人发现，本技术所获得的这些人源化抗体候选物，具有和人鼠嵌合抗cd24单克隆抗体wt基本相当的对cd24抗原的亲和力，且表现出强劲的体内抗肿瘤能力。2、其中，人鼠嵌合抗cd24单克隆抗体wt具有如seq id no.1所示氨基酸序列的轻链可变区vl0，和如seq id no.5所示的氨基酸序列的重链可变区vh0。3、本发明提供了一种能够特异性识别cd24的人源化抗体或其抗原结合片段，该人源化抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区；其中：4、所述轻链可变区包括轻链的互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3，氨基酸序列分别如seq id no.28～30任意一项所示；5、所述重链可变区包括重链的互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3，氨基酸序列分别如seq id no.31～33任意一项所示。6、优选的，所述轻链的互补决定区cdr1选自seq id no.28，互补决定区cdr2选自seqid no.29，互补决定区cdr3选自seq id no.30；7、所述重链的互补决定区cdr1选自seq id no.31，互补决定区cdr2选自seq idno.32，互补决定区cdr3选自seq id no.33。8、优选的，所述的重链可变区还包括重链框架区，所述的轻链可变区还包括轻链框架区。9、更优选的，所述重链框架区和所述轻链框架区均来自于人源igg抗体。10、进一步优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2～4任意一项所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.6～9任意一项所示。在本技术中，seq id no.2～4依次被称为vl1～vl3。seq id no.6～9依次被称为vh1～vh4。11、优选的，所述人源化抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述轻链恒定区为人源kappa轻链的轻链恒定区；所述重链恒定区为人源igg重链的重链恒定区。具体的，所述轻链恒定区的全长氨基酸序列如seq id no.10所示；所述重链恒定区的全长氨基酸序列如seq id no.11所示。12、具体的，所述人源化抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如seq id no.12～14任一项所示的轻链和氨基酸序列如seq id no.15～18任一项所示的重链。在本技术中，seqid no.12～14依次被称为l1～l3。seq id no.15～18依次被称为h1～h4。另外，人鼠嵌合抗cd24单克隆抗体wt具有seq id no.19所示氨基酸序列的轻链l0，和seq id no.20所示氨基酸序列的轻链h0。13、在本技术中，上述l1和h1所组成的具有igg1重链同型和kappa同型轻链的人源化单克隆抗体被称为hab-l1h1，上述l2和h1所组成的具有igg1重链同型和kappa同型轻链的人源化单克隆抗体被称为hab-l2h1，上述l3和h2所组成的具有igg1重链同型和kappa同型轻链的人源化单克隆抗体被称为hab-l3h2。依次类推。14、根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗。15、根据本发明的实施例，所述单抗包括cdr移植抗体、全长抗体、fv、单链抗体、fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。16、本发明还提供了编码所述人源化抗体或其抗原结合片段的核酸。17、根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段可特异性靶向结合人cd24分子，阻断siglec10和cd24的结合。18、根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以包括以下附加技术特征中的至少之一：19、根据本发明的实施例，所述核酸分子为dna。20、所述核酸包括编码轻链的核酸和编码重链的核酸；所述编码轻链的核酸的核苷酸序列如seq id no.21～23任一所示，所述编码重链的核酸的核苷酸序列如seq id no.24～27任一所示。21、其中，上述seq id no.21～23所示核苷酸序列分别编码轻链l1～l3，上述seq idno.24～27所示核苷酸序列分别编码重链h1～h4。划线部分分别编码轻链可变区vl1～vl3，以及重链可变区vh1～vh422、根据本发明的实施例，编码抗体轻重链信号肽的核苷酸序列如seq id no.34所示。kozak序列为accacc。23、在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别cd24的人源化抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述人源化抗体或抗原结合片段的体外大量获得。24、根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：25、根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。进而实现前面所述的特异性识别cd24的人源化抗体或其抗原结合片段在真核细胞中的表达，如hek293细胞。26、在本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，或者表达前面所述的人源化抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别cd24的人源化抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。27、根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过转染或电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。28、根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞29、根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。30、在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的人源化抗体或表达的人源化抗体具有和人鼠嵌合抗cd24单克隆抗体wt基本一致的对cd24分子的亲和力，且表现出良好的体内活性，有效抑制肿瘤的生长。31、本发明还提供了所述人源化抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗cd24过表达引起的疾病的药物中的应用。所述疾病为结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃腺癌或胶质母细胞瘤。32、本发明的有益效果：33、本发明将鼠源抗cd24单克隆抗体的fr区和恒定区替换为人源的，保留鼠源抗cd24单克隆抗体可变区的cdr，得到了一系列的抗cd24的人源化单克隆抗体。本发明获得的人源化抗体，具有和人鼠嵌合抗cd24单克隆抗体wt基本相当的对cd24抗原的亲和力，且表现出强劲的体内抗肿瘤能力。当前第1页12当前第1页12