一种构建IGHV基因文库的引物组合及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学，涉及一种构建ighv基因文库的引物组合及其应用。

背景技术：

1、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cll)是最常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病。cll患者的临床病程和转归呈高度异质性，部分患者生存时间同同年龄的正常人相同，而部分患者的疾病进程发展很快短时间内就会死亡。有些病人患有惰性疾病，多年来不需要治疗，而另一些则需要早期治疗干预。因此，预后相关因素研究对临床策略的决定具有重要的指导意义。与cll预后密切相关的因素有：疾病分期、血清β2微球蛋白、乳酸脱氢酶(ldh)、zap-70、cd38等，而免疫球蛋白重链可变区(ighv)基因突变是cll最重要的独立预后因素之一。

2、以表达免疫球蛋白重链多肽的igh基因为例，在未分化的淋巴细胞中，igh基因主要由可变区(variabl v)、多样区(diversity d)、连接区(joining j)组成，每个基因区域均由多个基因片段组成。随着淋巴细胞从母细胞分化到成熟淋巴细胞，原始的igh基因在重组酶的作用下，剪切各个基因区域中的某一片段，并重新连接，形成新的具有表达功能的基因。

3、近年来，重新排列的免疫球蛋白重链可变区(ighv)基因在大部分慢性淋巴细胞白血病(cll)患者中的突变状态的测定显示出具有较强的独立预后价值。因此，ighv突变状态被认为是临床试验中最重要的预后指标之一。目前ighv突变状态检测的方法主要是依赖于一代测序平台，但是由于技术的局限性，一代测序检测ighv还存在着以下缺点：（1）检测灵敏度低；（2）只适应相对较少的病例；（3）每一工作流程最终得到结果只有ighv突变单一结果；（4）无法检测亚克隆结果及克隆多样性信息；（5）测序前端和后端测序质量差，导致ighv突变结果不准确。

4、综上所述，开发高效、稳定的检测ighv基因突变的方法，对于igh基因研究领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种构建ighv基因文库的引物组合及其应用，采用高通量测序的手段检测ighv基因突变，显著提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到序列信息。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种构建ighv基因文库的引物组合，所述引物组合包括leader引物和/或fr1引物，所述leader引物包括6条前置引物和3条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括seq id no.1~seq id no.6所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括seq id no.7~seq id no.9所示的序列，所述fr1引物包括15条前置引物和2条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括seq id no.10~seq id no.24所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括seq id no.25~seq id no.26所示的序列。

4、本发明深入分析ighv基因结构，巧妙设计多组引物组合，leader引物的前置引物位于igh基因前导区，其能够扩增全长的ighv基因序列，能够全方面的分析ighv突变状态；fr1引物的前置引物位于igh基因的fr1区，能够配合leader引物使用，保证准确、稳定扩增得到ighv基因序列，得到基因文库，便于进行高通量测序分析。

5、seq id no.1：gtaaaacgacggccagtccatggactgkarrtggagvrta。

6、seq id no.2：gtaaaacgacggccagtatggacacactttgcttcacrctg。

7、seq id no.3：gtaaaacgacggccagtccatggagttmggrctbhgctgc。

8、seq id no.4：gtaaaacgacggccagtacatgatccarctgtgttcttca。

9、seq id no.5：gtaaaacgacggccagtatggggtcaaccgccatcct。

10、seq id no.6：gtaaaacgacggccagtatgtctgtctccttcctcatt。

11、seq id no.7：taatacgactcactatagggttgtagcgggatgcacg。

12、seq id no.8：taatacgactcactatagggaagtagtcctcggaccaga。

13、seq id no.9：taatacgactcactataggggaggctcagtggggagacctg。

14、seq id no.10：gtaaaacgacggccagtctggggctgaggtgaagaaat。

15、seq id no.11：gtaaaacgacggccagtgcagtctggagcagaggtgaatt。

16、seq id no.12：gtaaaacgacggccagttcaccttgaaggagtctggtct。

17、seq id no.13：gtaaaacgacggccagtaggtgtagctgagtggagta。

18、seq id no.14：gtaaaacgacggccagtgaggtgcagctgttgacagta。

19、seq id no.15：gtaaaacgacggccagtccaggactggtgaagccttc。

20、seq id no.16：gtaaaacgacggccagtcagtggggcgcaggactgtc。

21、seq id no.17：gtaaaacgacggccagtccaggactgtttgagcgcctct。

22、seq id no.18：gtaaaacgacggccagtgtacagctgtagccggtcagc。

23、seq id no.19：gtaaaacgacggccagtgctgctgcaatctttacgtcta。

24、seq id no.20：gtaaaacgacggccagtcctcagtgaagatgtccttcaags。

25、seq id no.21：gtaaaacgacggccagtaaacccacagagatcctcacgctt。

26、seq id no.22：gtaaaacgacggccagtctggggggtcgctgagccactcctg。

27、seq id no.23：gtaaaacgacggccagtcttcacagagcctgtctctaaccta。

28、seq id no.24：gtaaaacgacggccagtacgcagagcctcttactctcctgtc。

29、seq id no.25：taatacgactcactatagcgcttaccagatgatacggtgacg。

30、seq id no.26：taatacgactcactatagggctgacctgagtagacagtgaca。

31、以上序列存在简并碱基，其中r=a/g，m=a/c，k=g/t，s=c/g，h= a/c/t，b= c/g/t，v=a/c/g。

32、本发明适用于ion torrent高通量测序平台。

33、可选地，所述引物组合还包括接头引物。

34、可选地，所述接头引物包括ion torrent平台接头引物。

35、可选地，所述接头引物包括12条前置引物和1条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括seq id no.27~seq id no.38所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括seq idno.39所示的序列。

36、seq id no.27：

37、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccgcatggaacgatgtaaaacgacggccag。

38、seq id no.28：

39、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagctggcaatcctcgatgtaaaacgacggccag。

40、seq id no.29：

41、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccggagaatcgcgatgtaaaacgacggccag。

42、seq id no.30：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtccacctcctcgatgtaaaacgacggccag。

43、seq id no.31：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagcagcattaattcgatgtaaaacgacggccag。

44、seq id no.32：

45、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctggcaacggcgatgtaaaacgacggccag。

46、seq id no.33：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtcctagaacacgatgtaaaacgacggccag。

47、seq id no.34：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtccttgatgttcgatgtaaaacgacggccag。

48、seq id no.35：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctagctcttcgatgtaaaacgacggccag。

49、seq id no.36：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtcactcggatcgatgtaaaacgacggccag。

50、seq id no.37：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagttcctgcttcacgatgtaaaacgacggccag。

51、seq id no.38：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccttagagttcgatgtaaaacgacggccag。

52、seq id no.39：ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgattaatacgactcactataggg。

53、第二方面，本发明提供第一方面所述的构建ighv基因文库的引物组合在制备检测ighv基因的产品中的应用。

54、第三方面，本发明提供一种检测ighv基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的构建ighv基因文库的引物组合。

55、优选地，所述试剂盒还包括多重pcr扩增试剂和/或测序接头扩增试剂；

56、优选地，所述多重pcr扩增试剂包括dna聚合酶和扩增缓冲液；

57、优选地，所述测序接头扩增试剂包括dna聚合酶和扩增缓冲液。

58、第四方面，本发明提供第一方面所述的构建ighv基因文库的引物组合在检测ighv基因中的应用。

59、第五方面，本发明提供一种构建ighv基因文库的方法，所述方法包括：

60、以待测样本的核酸为模板，利用第一方面所述的构建ighv基因文库的引物组合进行多重pcr扩增，将多重pcr扩增产物与所述接头引物混合，进行接头pcr扩增反应，得到所述ighv基因文库。

61、优选地，所述待测样本包括外周血、骨髓或ffpe样本中任意一种。

62、优选地，所述多重pcr扩增的条件为：（1）93~96℃预变性8~12 min；（2）93~95℃变性1~3 min、60~65℃退火1~3 min、70~73℃延伸25~35 s，30~40个循环；（3）70~73℃延伸8~12 min；优选为（1）94℃预变性10 min；（2）94℃变性1 min、63℃退火1 min、72℃延伸30 s，35个循环；（3）72℃延伸10 min。

63、优选地，所述接头pcr扩增反应的条件为：（1）94~96℃预变性10~14 min；（2）93~95℃变性25~35 s、60~65℃退火25~35 s、70~73℃延伸25~35 s，18~23个循环；（3）70~73℃延伸3~6 min；优选为95℃预变性12 min；（2）94℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，20个循环；（3）72℃延伸5 min。

64、第六方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的检测ighv基因突变的方法，所述方法包括：

65、利用第五方面所述的构建ighv基因文库的方法构建ighv基因文库，对所述ighv基因文库进行纯化，将纯化后ighv基因文库进行上机测序及数据分析，判断ighv基因突变情况。

66、优选地，所述纯化的方法包括磁珠纯化法。

67、本发明设计特定的引物组合，保证准确、稳定扩增得到ighv基因序列，得到基因文库，同时结合高通量测序技术，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，具有广泛的应用前景，例如得到的受体识别区序列可以应用在细胞免疫研究领域等。

68、第七方面，本发明提供一种检测ighv基因突变的装置，所述装置包括文库构建单元和测序单元；

69、所述文库构建单元用于执行包括：

70、利用第五方面所述的构建ighv基因文库的方法构建ighv基因文库，对所述ighv基因文库进行纯化；

71、所述测序单元用于执行包括：

72、将文库构建单元纯化后ighv基因文库进行上机测序及数据分析，判断ighv基因突变情况。

73、第八方面，本发明提供一种用于ighv基因突变的高通量测序检测的系统，所述系统包括第三方面所述的检测ighv基因突变的试剂盒和高通量测序平台。

74、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

75、本发明巧妙设计多组引物组合，leader引物的前置引物位于igh基因前导区，其能够扩增全长的ighv基因序列，能够全方面的分析ighv突变状态；fr1引物的前置引物位于igh基因的fr1区，能够配合leader引物使用，保证准确、稳定扩增得到ighv基因序列，得到基因文库，便于进行高通量测序分析，实现了ighv基因突变的稳定检测。