一种基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针及其制备方法与应用

本发明属于免疫检测。更具体地，涉及一种基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析技术是当前食品小分子有害物快速检测的研究热点。其优势在于灵敏、简便、快速、成本低，尤其适合我国农产品量大面广的生产现状。免疫分析技术的核心主要在两方面，一是抗体，抗体性能直接影响到检测的特异性和灵敏度；二是检测模式，高效的检测模式可使方法的灵敏度更高、特异性更强且检测速度更快。同时，这二者相互联系，抗体性能与检测模式的匹配性对于最终检测技术的建立尤其重要。

2、上世纪90年代，比利时科学家hamers等发现在骆驼科及软骨鱼类等动物体内，存在一种天然缺失轻链的重链抗体，其抗原结合位点仅由抗体重链可变区组成，通过基因工程技术克隆其重链可变区，即可得到纳米抗体。纳米抗体是目前已知的保留完整抗原结合活性的最小单元。相比传统的多/单克隆抗体及单链抗体或抗原结合片段抗体，纳米抗体稳定性好，表达水平高，且作为重组抗体易于分子改造以提升性能，在免疫检测中优势突出，是一种极具研究前景的新型小分子抗体。特别是基于荧光标记纳米抗体构建的抗原触发式荧光探针，可实现小分子的均相、非竞争免疫分析，相比传统的固相、竞争免疫分析模式，更灵敏简便。

3、但研究发现，并非所有抗体(包括纳米抗体)都适合构建抗原触发式荧光探针。抗体的初始结构、所含色氨酸的位置与荧光素基团之间的距离、以及小分子药物结合前后抗体构象的变化方式都可能影响荧光标记抗体的光诱导电子转移效应的(photoinducedelectronics transfer，pet)的发生与阻断。这也导致了现有探针制备时存在极大的盲目性和随机性。因此，如何能够准确调控纳米抗体的pet效应是突破当前小分子触发式荧光探针制备瓶颈的关键。

4、pet免疫分析方法是一种灵敏、高效的均相、非竞争荧光免疫分析模式，但存在已有靶标抗体难以匹配检测模式的问题，特别是针对小分子半抗原的抗体时尤其困难。其原因是荧光标记抗体探针的pet效应的“开关”受到诸多因素的影响，比如抗体结构、荧光素基团-抗体色氨酸基团以及抗原相互作用等。为了更好的利用已有纳米抗体资源，实现小分子药物pet荧光免疫探针精准设计，亟需开发和研究出更多的能够基于小分子抗原触发式荧光探针进行检测的新方法策略，创新食品中小分子有害物免疫分析模式。

5、喹硫磷是一种广谱性有机磷农药，广泛应用于农业病虫害防治。因其具有较强的神经毒性，被美国环境保护署归类为毒理学ⅰ类(剧毒)。鉴于其高毒性和污染水平，许多国家和组织设定了喹硫磷在蔬菜和水果中的最大残留限量，包括中国(0.5mg/kg)，欧盟(0.01mg/kg)和世界卫生组织(0.08mg/kg)。为了尽量减少喹硫磷残留的暴露并预先警示食品安全问题，有必要开发一种快速、灵敏的检测农产品中喹硫磷的检测方法。目前，尚未有基于喹硫磷纳米抗体的pet免疫分析方法用于检测喹硫磷的报道。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有pet免疫分析方法的缺陷和不足，提供一种基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针及其制备方法和应用，实现更灵敏、高效的均相、非竞争免疫分析新模式的喹硫磷检测。

2、本发明的目的是提供一种基于纳米抗体的抗原触发式荧光探针。

3、本发明另一目的是提供所述荧光探针的应用。

4、本发明再一目的是提供一种靶标喹硫磷的pet免疫分析方法。

5、本发明又一目的是提供所述荧光探针的制备方法。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、本发明提供一种基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针，所述荧光探针为n端连接有荧光素染料的喹硫磷纳米抗体突变体；喹硫磷纳米抗体突变体为野生型喹硫磷纳米抗体第29位精氨酸突变为色氨酸(r29w)，野生型喹硫磷纳米抗体的氨基酸序列如seq idno.1所示。

8、本发明通过对喹硫磷纳米抗体复合物的晶体结构、分子对接模拟突变，筛选出抗原结合区域的关键氨基酸位点，进一步制备得到抗原触发式荧光探针，能用于喹硫磷的检测，具有较高的特异性及灵敏度。基于此，本发明建立了一种靶标喹硫磷的pet免疫分析方法，无需洗涤和分离操作，操作便捷快速，在15min快速获得检测结果，检测限为0.007μg/ml，检测范围为0.015～0.255μg/ml，实现了喹硫磷检测的非竞争且均相、高灵敏检测。

9、进一步地，所述野生型喹硫磷纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、进一步地，所述喹硫磷纳米抗体突变体r29w的氨基酸序列如seq id no.10所示。

11、优选地，所述喹硫磷纳米抗体突变体r29w的编码基因的核苷酸序列如seq idno.9所示。

12、优选地，所述荧光探针n端连接有荧光素染料为n末端融合表达了半胱氨酸多肽(cys)并连接荧光素染料，通过半胱氨酸多肽上的巯基与荧光素上的马来亚酰胺进行共价键定向偶联。

13、优选地，所述荧光素染料为atto520、tamra、或r6g。

14、更优选地，所述荧光素染料为atto520。

15、本发明提供上述基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针在检测喹硫磷中的应用。

16、本发明提供上述基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针在制备检测喹硫磷的产品中的应用。

17、本发明还提供一种靶标喹硫磷的pet免疫分析方法，采用上述基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针进行检测。

18、本发明还提供所述荧光探针的制备方法，以n末端融合表达了半胱氨酸多肽的纳米抗体突变体和荧光素染料在还原条件下进行反应，具体步骤如下：

19、s1.将喹硫磷纳米抗体突变体r29w的编码基因插入载体，经无缝连接，再诱导表达，纯化，得到纳米抗体突变体；

20、s2.将步骤s1制备得到的纳米抗体突变体与荧光素染料进行偶联，孵育，即得纳米抗体荧光探针。

21、优选地，步骤s1中采用seq id no.5～6所示引物进行扩增，将喹硫磷纳米抗体突变体r29w的编码基因插入载体中。

22、优选地，步骤s1中所述载体为5’端(即对应n末端)表达了半胱氨酸多肽的载体；采用seq id no.11～12所示引物进行扩增将半胱氨酸多肽插入载体的5’端。

23、更优选地，所述载体为pcomb3xss。

24、优选地，步骤s2中纳米抗体突变体与荧光素染料的用量摩尔比为1：10～1：20。

25、优选地，步骤s2中偶联，孵育的具体方法为：将0.1～0.5mg纳米抗体突变体与0.5mm tcep混合，室温避光反应0.5～1h。将2mm对叠氮苯甲酸加入s1的反应液中，冰上孵育10min。立即加入1mm atto520荧光素染料，室温避光反应2h。采用0.01m ph 7.4的pbs缓冲液透析6次，12000rpm离心5min，收集上清，即得。

26、本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供一种基于喹硫磷纳米抗体的抗原触发式荧光探针，所述荧光探针为n端连接有荧光素染料的喹硫磷纳米抗体突变体；喹硫磷纳米抗体突变体为野生型喹硫磷纳米抗体第29位精氨酸突变为色氨酸(r29w)，其野生型喹硫磷纳米抗体的氨基酸序列如seqid no.1所示。本发明通过对喹硫磷纳米抗体复合物的晶体结构、分子对接模拟突变，筛选出抗原结合区域的关键氨基酸位点，进一步制备得到抗原触发式荧光探针，能用于喹硫磷的检测，具有较高的特异性及灵敏度。基于此，本发明建立了一种靶标喹硫磷的pet免疫分析方法，无需洗涤和分离操作，操作便捷快速，在15min快速获得检测结果，检测限为0.007μg/ml，检测范围为0.015～0.255μg/ml，实现了喹硫磷检测的非竞争且均相、高灵敏检测。

28、本发明针对当前食品中小分子有害物免疫分析中“固相竞争分析模式”灵敏度有限、检测步骤繁琐的技术瓶颈，结合结构生物学、生物信息学及分子生物学等，以喹硫磷农药为对象，提供了一种基于纳米抗体用于检测喹硫磷的抗原触发式荧光探针及其制备方法与应用。首次提出基于喹硫磷纳米抗体复合物的晶体结构解析，分子对接模拟突变等策略，为食品中小分子有害物的抗原触发式荧光探针的定向设计提供了新思路。首次基于构建的喹硫磷纳米抗体荧光探针建立灵敏、高效的均相、非竞争免疫分析新模式；进而建立一种基于小分子抗原触发式荧光探针设计新策略，创新食品中小分子有害物免疫分析模式。