叶锈病抗性相关蛋白AcLRR2P-1及其生物材料和应用

本发明具体涉及叶锈病抗性相关蛋白aclrr2p-1及其生物材料和应用。

背景技术：

1、小麦(triticum aestivum l.)是世界上种植面积最大的作物，养活了全球40％的人口，但病害严重威胁着小麦的产量。叶锈病是小麦真菌病害，由叶锈菌(pucciniatriticina)引起，严重可造成高达50％的产量损失。培育抗性品种是经济环保的育种措施，然而，由于病原菌株不断变化导致新的毒性菌株产生以及长期种植单一抗病品种，导致原有抗病品种失去抗病效应。发掘、克隆小麦新的抗病基因可以加快抗病育种进程，对培育持久抗病品种具有重要意义。小麦栽培品种抗叶锈病基因比较匮乏，发掘新的抗叶锈病基因对于抗病育种应用具有重要意义。

技术实现思路

1、本技术所要解决的技术问题是如何提高植物叶锈病抗性，尤其是小麦。

2、为了解决上述问题，本技术提供了下述应用。

3、蛋白质、提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或提高所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；

4、a1)提高植物叶锈病抗性中的应用和/或制备提高植物叶锈病抗性的产品中的应用；

5、a2)植物育种中的应用和/或制备植物育种的产品中的应用；

6、所述蛋白质为如下任一种：

7、b1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

8、b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

9、b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

10、序列2具体如下所示：

11、mspvqslpliilvlsslltcsllgaaalhgdastdfqalrclklhlsisssgipaswkiddslqqfctwsgvtcskrhtsrvvaldleslhlngqippcianltlltrihlpdnqlwgpipaelgqlnrlrylnlssnnlsgiipsnlsscsqlqfidlgrnfingvipstlgnfsslsvlllgdnsfqgsipvsigfgviickkkkkgkqaahpsvkelkkftyvdlvkatngfslanlvgsgtygsvykarteseehhtvaikvfkldqlgatksfiaecealrntrrrnlvrvitvcstsdltgnefkalvlefmvngdleswlhptllhehhpkrplclgsritisvgiaaaldylhnqcmppmvhcdlkpsnvllddvmdarvgdfglakflhgcssssgidsstslvgprgsvgyiapeygfgskistdgdvysygviilemltgkrptdemfkdglslykfvedsfpekiykildpriiipyygnrdeeeagsssgqenhqmaagivscitaltklglqcaaetpkdrpamqdvyadataikeafaalhg。

12、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

13、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

14、上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

15、上述蛋白质中，序列2(seq id no.2)由个557个氨基酸残基组成。将其命名为aclrr2p-1蛋白。其编码基因为aclrr2p-1基因。

16、本技术中，所述育种的目的包括培育高叶锈病抗性植物。

17、所述高叶锈病抗性植物与目的植株相比叶锈病抗性提高。

18、上述的应用中，其特征在于，所述蛋白来源于小麦-冰草抗病易位系2pt5。

19、上文中，所述小麦可为小麦品系fielder。

20、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

21、上述的应用中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：

22、d1)、编码上述蛋白质的核酸分子；

23、d2)、含有d1)所述核酸分子的表达盒；

24、d3)、含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；

25、d4)、含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；

26、d5)、含有d1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有d2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

27、d6)、含有d1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d3)所述重组载体的转基因植物组织；

28、d7)、含有d1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d3)所述重组载体的转基因植物器官。

29、d1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质aclrr2p-1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质aclrr2p-1的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质aclrr2p-1且具有蛋白质aclrr2p-1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

30、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

31、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

32、本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为pwmb110载体；

33、上述生物材料中，d2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。

34、上述d3)中，所述重组载体可为用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa、pmdc85或pcambia1391-xb。使用ossoar1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。作为一个具体实施例，本技术使用pwmb110载体作为表达载体。

35、作为一个具体实施例，所述重组微生物中的微生物菌株可为农杆菌c58c1。

36、上述的应用中，d1)所述的核酸分子可为核苷酸序列为序列1或3所示的dna分子。

37、序列1具体如下：

38、atgtctcctgtgcagtcactgcctctaataatccttgtcctatcttctctcttgacatgttcattactaggtgccgccgcactccacggtgatgctagcactgacttccaagccctccgttgccttaaactccatctcagcatttcttcatctggaatcccagcctcatggaagattgatgattccctccaacagttctgcacttggtccggtgttacttgcagcaagaggcacacatctcgtgttgttgcactggacctcgagtcgctccaccttaatggccaaataccgccttgcattgcaaacctcactctcctcacaagaatccacctcccagacaatcagctttggggtccaatcccagctgaacttgggcaactgaataggttgaggtatcttaacctcagctcaaacaatcttagtggcatcatcccaagcaatctatcctcatgctctcagcttcaattcattgatcttgggaggaacttcatcaatggtgtgataccttctactctagggaatttttcttcccttagcgtgctcttacttggagataacagttttcaaggtagcatcccagtgagtattggctttggagtcattatttgtaagaagaaaaagaaaggcaaacaagcagcacatccatctgtcaaggagttaaagaagttcacatatgtcgatttagtgaaagcaacaaatggtttttctttggccaacttggttggttcaggaacatatgggtctgtatacaaagctagaactgagtctgaagagcatcatacagttgctatcaaagttttcaaactcgatcaacttggagcaacaaagagtttcattgctgaatgtgaggcactgagaaacactcgtcgtcgtaatcttgtaagggtgatcaccgtatgctcaacaagtgacctgacgggaaatgagttcaaagctcttgttcttgagtttatggtaaatggcgacctagagagttggctccatccaacactgctccacgagcatcatccaaaaaggccgttgtgtttgggttcaagaataacaatatcagtgggcatagctgctgctttggattacctccataaccaatgcatgcctcctatggtccactgtgatctgaagcctagcaatgtccttctagatgatgtcatggacgcacgtgttggtgactttgggttggctaagtttctacatggttgttcttcttcttcggggattgattcttctacaagcttagtggggccaagaggatcagttggatacattgcaccagaatatggatttgggagcaaaatctccacggatggtgatgtttacagctatggagtcattatcttagagatgctcacagggaagcgtccaactgatgagatgtttaaagatggcctgagcctttacaaatttgtcgaagactcatttcctgagaagatctacaagattctagatcctagaatcatcattccctattatgggaaccgagatgaagaagaagcagggagttcctcaggccaggaaaatcatcaaatggctgcaggaatagtgagctgcatcactgctctcactaagcttggcctgcaatgcgccgcggagacaccgaaagatcgcccagcgatgcaggacgtttacgctgatgccaccgcaatcaaagaagcatttgcagcactgcacggc。

39、上述的应用中，所述植物为如下任一种：

40、g1)单子叶植物；

41、g2)禾本科植物；

42、g3)小麦属植物；

43、g4)小麦。

44、为了解决上述问题，本技术还提供了一种培育高叶锈病抗性物的方法。

45、所述方法包括上调或增强或提高目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高叶锈病抗性物，所述高叶锈病抗性物的叶锈病抗性高于所述目的植物。

46、为了解决上述问题，本技术还提供了一种提高植物叶锈病抗性的方法。

47、所述方法包括将通过上调或增强或提高植物中上述蛋白质的编码基因的表达，和/或，上述蛋白质的活性和/或含量来提高植物叶锈病抗性。

48、本技术中，所述植物可为小麦。所述小麦可为小麦品系fielder。

49、上述的方法中，所述上调或增强或提高植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入上述的核酸分子、表达盒或重组载体。

50、上文中，所述核酸分子可为序列1或序列3所述的核酸分子。

51、上述的方法中，所述植物为如下任一种：

52、j1)单子叶植物；

53、j2)禾本科植物；

54、j3)小麦属植物；

55、j4)小麦。

56、本技术中，所述小麦可为小麦品系fielder。

57、为了解决上述问题，本技术还提供了蛋白质或物质。

58、所述蛋白质或所述物质为上述蛋白质或上述物质。

59、有益效果

60、本技术公开了叶锈病抗性相关蛋白aclrr2p-1及其生物材料和应用。本技术通过转录组测序发现了与叶锈病菌侵染相关的基因aclrr2p-1。将基因aclrr2p-1插入表达载体pwmb110。构建重组质粒pwmb110-aclrr2p-1，所述重组质粒pwmb110-aclrr2p-1是用序列3自5'端第1-3619位核苷酸所示的dna片段替换pwmb110载体的限制性酶切酶sac i识别位点之间的片段，pwmb110载体的其它核苷酸序列不变，得到重组质粒pwmb110-aclrr2p-1。

61、将重组质粒pwmb110-aclrr2p-1转入农杆菌，进而转入小麦。获得阳性植株t0-1、t0-2、t0-3、t0-4、t0-5、t0-6，并对阳性植株(t0-1、t0-2、t0-3、t0-4、t0-5、t0-6)及阴性植株t0-7进行叶锈菌抗性实验，以fielder作为阴性对照；通过表达量鉴定，选择阳性过表达量高的三个小麦株系t0-1、t0-4和t0-5的t1代进行叶锈菌抗性实验，以fielder作为阴性对照。结果表明，阳性过表达小麦株系t0-1、t0-4和t0-5以及其t1代阳性植株对叶锈菌表现为高抗，而阴性植株t0-7、fielder和t1代阴性植株对叶锈菌表现为感病。