一种用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片及其制备方法和应用与流程

本发明属于细菌菌片，具体涉及一种用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片及其制备方法和应用。

背景技术：

1、冷链食品在运输、储存过程中一直保持低温状态，病毒和微生物如诺如病毒、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌等在冷链食品如果蔬、速冻食品的外包装和表面可存活较长时间，为保障食品安全，需要定期对冷链食品外包装和表面进行消毒。

2、在没有明确的传染源存在时，对可能受到病原微生物污染的场所和物品进行的消毒称为预防性消毒。

3、为监测冷链食品的预防性消毒效果，需要进行消毒效果评价，针对现场消毒效果进行的评价，通过测试消毒前后微生物的减少量，评价现场消毒工作质量是否合格。尤其对于冷链食品，其温度一般处于0～4℃或0℃以下，在此环境下对物品进行消毒，称为低温消毒，常温的消毒方式在低温环境下效果可能会大打折扣，低温消毒需使用在该温度下被证明有效的消毒因子。

4、常用的低温消毒剂有84消毒液、二氧化氯消毒液、次氯酸、二氯异氰尿酸、三氯异氰尿酸、氯化钙等含氯消毒剂，采用电动臂复式喷雾器、背负式自动喷雾器、加压雾化消毒器、全方位通道式消杀系统、全方位喷雾轨道消杀系统等器械进行喷雾消毒。冷链食品的外包装多采用纸箱。

5、目前国内进行低温现场消毒效果评价时，指示微生物的染菌载体多采用金属片，优点是载体表面平整光滑，细菌在其表面不易失活，菌片的回收菌数高，缺点是载体的属性和冷链食品的外包装如纸箱等材质相差甚远，对菌液、消毒剂的吸附性差异较大，不能很好模拟消杀效果。

6、消毒剂喷雾消毒方式，对金属表面进行喷洒或浸泡冲淋，很容易将其表面菌体洗脱或杀灭，但纸箱是多孔材质，对细菌、病毒、消毒液都具有吸附性，可能会导致消毒液在其表面分布不均，导致杀菌不彻底。相同成分相同浓度的消毒剂，对相同回收菌数的金属表面和纸箱表面的消毒效果并不一致，金属表面的杀灭率更高。合适的染菌载体更能体现真正的消毒效果。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片的制备方法。

2、本发明的目的还在于提供采用上述方法制备得到的用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片。

3、本发明的最后一个目的在于提供上述细菌菌片在低温现场纸箱表面消毒效果评价中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过下述技术方案来实现：一种用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)载体的选择：采用定性滤纸作为载体，并经灭菌处理；

6、(2)染菌用菌悬液的制备：

7、2.1工作菌株的制备

8、采用标准贮备菌株作为工作菌株，将标准贮备菌株进行复苏，包括：

9、在标准贮备菌株干粉中加入脑-心浸萃液态培养基bhi，将干粉制成悬浮液，然后用接种环划线接种于非选择性培养基平板上，置于36±1℃培养18～24h，用于标准贮备菌株纯度和关键特性确认；

10、将悬浮液转移到脑-心浸萃液态培养基bhi中，置于36±1℃培养18～24h，采用-80℃低温冷冻保藏法进行保存，即为第1代标准储备菌株，用接种环取第1代标准储备菌株，划线接种于非选择性培养基平板，置于36±1℃培养18～24h，即为第2代培养物，挑取第2代培养物，划线接种于非选择性培养基平板，置于36±1℃培养18～24h，以此类推，得第3～8代培养物；

11、2.2细菌菌悬液的制备

12、取2.1中制备的第3～8代培养物，划线接种于适合该菌株生长的非选择性培养基平板，置于36±1℃培养18～24h，得到新鲜纯培养物，用无菌棉拭子挑取足量的新鲜纯培养物，置于含有无菌生理盐水的容器中，初步制成菌悬液；

13、将初步制成的菌悬液，先用麦氏比浊仪测定其比浊度，推测其含菌浓度，然后用无菌生理盐水稀释至所需浓度；

14、(3)滴染法染菌

15、3.1将步骤2.2中制成的菌悬液，加入有机干扰物制得菌液；

16、3.2将步骤(1)中灭菌后的载体平铺于无菌容器内，用移液器逐片滴加步骤3.1中的菌液，静置10～20min待载体吸收菌液，即得用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片。

17、在上述用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片的制备方法中：

18、可选地，步骤(1)中定性滤纸的尺寸为1.0～1.5cm×1.0～1.5cm的正方形。

19、本发明中纸片的规格设定较小，可避免消杀和中和过程中的不稳定性。

20、定性滤纸的材质与纸箱相似，采用定性滤纸作为染菌载体更具代表性，更能反映真实的消毒效果。

21、但定性滤纸作为染菌载体也存在一些缺点：如对菌液的接受度较低，菌片的回收菌数也较低，不容易达到1×106cfu/片～5×106cfu/片的要求；跟纸箱一样，由于对消毒液具有一定的吸附性，可能会导致消毒液在其表面分布不均，导致消毒不彻底。

22、本技术通过以上细菌菌悬液的制备方法比如通过控制细菌的活化，将活化流程标准化，控制菌悬液浓度，滴加方式，制备时间等，可得到比较精准的回收菌数，克服了定性滤纸制作而成的细菌菌片回收菌数较低的难题，精准控制在1×10 6cfu/片～5×106cfu/片的要求范围内。

23、而且，本发明方法采用定性滤纸作为染菌载体，材质与纸箱接近，菌片的回收菌数和杀灭率更能体现真实的消毒效果。

24、可选地，步骤(1)中灭菌处理时，将载体于121℃高压灭菌15min。

25、可选地，步骤2.1中所述标准贮备菌株为大肠埃希氏菌cicc 10899、大肠埃希氏菌atcc 25922、金黄色葡萄球菌cicc 10306、金黄色葡萄球菌atcc 25923、甲型副伤寒沙门氏菌cmcc(b)50093、单核细胞增生李斯特氏菌atcc 19115。

26、可选地，步骤2.1中标准贮备菌株纯度和关键特性确认中，纯度确认包括平板划线查看菌落形态、革兰氏染色或镜检菌体形态；关键特性确认包括特征生化反应、试剂盒鉴定、全自动微生物鉴定系统鉴定或微生物质谱仪鉴定。

27、可选地，步骤2.2中初步制成菌悬液的浓度为1.0×109～9.9×109cfu/ml。

28、更佳地，试验用细菌菌悬液的含量约为109cfu/ml，可用比浊仪调整菌悬液浓度。

29、初步制成的菌悬液，先用麦氏比浊仪测定其比浊度，推测其含菌浓度，然后用无菌生理盐水稀释至所需浓度，细菌菌悬液应现配现用，怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰氏染色镜检形态、生化鉴定等方法进行纯度鉴定。

30、步骤2.2中使用比浊仪测定菌悬液浊度，只能用于推测滴染菌片时菌悬液的初步浓度，作为菌悬液含量浓度或菌片染菌量的正式报告，应以活菌培养计数的实测结果为准，不能使用根据比浊法判定的估计值。

31、可选地，步骤2.1～2.2中所述非选择性培养基平板为营养琼脂(nutrient agar，na)平板或含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(tryptic soy agar with 0.6％ yeastextract，tsa-ye)平板。

32、可选地，步骤3.1中所述有机干扰物为质量百分含量为3.0％的牛血清白蛋白或胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth，tsb)，其加入量与菌悬液用量相同。

33、进一步地，步骤3.1中将步骤2.2中制成的菌悬液，加入等量的有机干扰物，制得菌液的浓度约为1×108～5×108cfu/ml。

34、步骤3.2中用移液器逐片滴加步骤3.1中的菌液，菌液滴加不宜过快，避免流散影响菌片的回收菌量。

35、可选地，步骤3.2中每个细菌菌片的回收菌量为1×106～5×106cfu/片。

36、可选地，步骤3.2中制备的细菌菌片置于-20℃冰箱保存。

37、制好的菌片应尽快放入-20℃冰箱，以减少细菌的自然死亡。

38、可选地，步骤3.2中制备的细菌菌片使用时，将细菌菌片固定于纸箱的前、后、上、下、左、右六个表面。

39、将细菌菌片用于低温现场消毒效果评价时，采用指示微生物法，用无菌大头针把菌片固定于纸箱前、后、上、下、左、右六个表面，喷雾消毒操作完成后静置20min～30min，等待消毒剂发挥作用，采用中和剂对细菌菌片进行中和，中和剂溶液配方为：0.5％硫代硫酸钠+1.5％吐温80+0.5％卵磷脂的pbs溶液，然后计算指示微生物平均杀灭率，评价低温现场纸箱表面消毒效果。

40、中和剂溶液可有效迅速终止消毒剂的继续消毒作用，使得消毒剂不再抑制或杀灭细菌，同时中和剂和中和产物对细菌和培养基也不会产生不良影响，减少了试验结果的偏差，提高了消毒效果评价试验的准确性。

41、指示微生物平均杀灭率≥99.9％，且杀灭率≥99.9％的细菌菌片样本数占90％以上，低温现场纸箱表面消毒效果判为消毒合格。

42、本发明的上述第二个目的可以通过下述技术方案来实现：一种用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片，采用上述任一项方法制备获得。

43、本发明的上述最后一个目的可以通过下述技术方案来实现：上述细菌菌片在低温现场纸箱表面消毒效果评价中的应用。

44、因此，本发明提供了一种用于低温现场纸箱表面消毒效果评价的细菌菌片(染菌载体)的制备方法，制备的细菌菌片适用于消毒效果评价对象为物体表面，可以指示微生物作为评价指标的低温现场的预防性消毒效果评价。

45、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

46、(1)本发明采用定性滤纸作为染菌载体，材质与纸箱接近，菌片的回收菌数和杀灭率更能体现真实的消毒效果；

47、(2)本发明克服了定性滤纸制作而成的细菌菌片回收菌数较低的难题，精准控制在1×106cfu/片～5×106cfu/片的要求范围内；

48、(3)本发明应用范围广，除了革兰氏阴性代表菌株大肠埃希氏菌cicc 10899、革兰氏阳性代表菌株金黄色葡萄球菌cicc 10306，还适用于冷冻食品中检出率较高的指示菌或者致病菌，如大肠埃希氏菌atcc 25922、金黄色葡萄球菌atcc 25923、甲型副伤寒沙门氏菌cmcc(b)50093、单核细胞增生李斯特氏菌atcc 19115等；

49、(4)本发明细菌菌片制作方法快速便捷，对环境设施设备的要求较低，由于现场消毒效果评价需在各冷链仓库等地点进行，采样点一般较为偏僻，距离各地实验室较远，便捷的制作方法更有利于各种条件下的现场消毒评价工作的实施和推广；

50、(5)本发明方法适用于各种细菌菌片的制备，能对低温现场消毒效果作出比较全面的评价；

51、(6)利用本发明方法制备的细菌菌片进行消毒效果评价，合格者可认为病毒或微生物得到了有效的杀灭，消除了病毒传播风险，有效保证了食品安全和消费者健康。