多肽生长因子PSK的一种合成方法与流程

本发明属于多肽合成，具体涉及到植物生长因子psk-α及的psk-β一种新的合成制备路线。

背景技术：

1、psk(phytosulfokine)是1996年由日本科学家matsubayashi和sakagami在芦笋叶肉细胞的条件培养基中分离并鉴定出结构的磺化生长因子，由约80个氨基酸长的前体蛋白经酪氨酸残基的翻译后磺化和蛋白水解加工而产生，剪切修饰后成熟的psk以两种形式存在：psk-α(phytosulfokine-α)和psk-β(phytosulfokine-β)，其中psk-α结构为tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh，psk-β的结构为tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh。

2、科学界经过多年的研究发现，psk多肽的前体蛋白在不同种植物中例如水稻、大豆、油菜、玉米、拟南芥都有存在，其结构高度保守，在整株植物中的叶、顶端分生组织和胚轴中都发现了psk的表达，说明psk在高等植物中是广泛存在且其受体覆盖这些植物的所有部位。

3、跟大部分的有天然氨基酸构成的多肽相比，psk的tyr上的酚羟基被磺化，这种结构的变化极大的增强了多肽与蛋白某些位点之间的结合能力，使得这种多肽具有了非磺化多肽不具有的一些活性。研究表明，纳摩尔级浓度的psk就可以对植物产生非常明显的作用，它能刺激黄瓜的果肉胚芽及旁根的发育，促进百日草叶肉细胞的分化，延长棉花的纤维长度，催熟水果并刺激花粉发芽及花粉管的延长，全方位增强叶根花果的发育，在农业上实现多种作物增产20-30%。

4、psk多肽还能激发植物的免疫系统以抵抗病原体的入侵，从而达到防治灰霉病、黄化曲叶病毒等植物病害的作用。仅以灰霉病这种全球性的真菌性病害为例，全球多达235种蔬菜、果树以及其他植物会受到灰霉菌的侵害，引起有些植物50%的减产，而psk能够帮助植物有效的抵抗真菌侵扰的困扰。

5、正是因为具有这些令人瞩目的作用，使得psk在农业生产上具有良好的产业化期待，根据农业上使用的特点，其大规模产业化显得尤为迫切。

6、关于psk的制备，目前大部分报道的方法是采用生物重组法，其操作难度大且成本高，仅能提供实验室研究的需要量。matsubayashi等报道了一种全固相化学合成方法(biochemical and biophysical research communications 225,209–214(1996))，主要是利用传统的固相方法合成了boc-tyr-ile-tyr-thr(tbu)-gln(trt)-hmp树脂或者boc-tyr-ile-tyr-thr(tbu)-hmp树脂，然后利用dmf-so3在固相上进行多肽磺化后得到boc-tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr(tbu)-gln(trt)-hmp树脂或者boc-tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr(tbu)-hmp树脂,再利用95%tfa将多肽从树脂上裂解下来并脱除保护基团，经过纯化就可以得到psk。正如同该文献提及，tyr酚羟基上的磺基在tfa条件下非常不稳定，在从树脂上切割下来的过程及后处理过程中，因为有tfa的存在，psk非常容易变质，纯化难度大，导致该工艺最终只有约21%的收率，由于该工艺成本高、收率低，很难实现量产。

7、要想实现该产品的社会价值及经济产业价值，开发一种能够规避磺基在tfa中暴露的工艺就非常重要，同时该工艺要能提高收率，降低成本，方便产业化放大生产。

技术实现思路

1、本发明所解决的问题就是针对现有工艺的不足，提供天然植物多肽生长因子psk产业化的工艺路线。

2、产品的生产主要是通过以下技术方案实现的。其特点是：利用固相法或者液相法合成得到非磺化多肽（五肽和四肽），再利用一种比较易得的气体so2f2对多肽酪氨酸上的酚羟基进行高选择性的磺酰氟化得到关键中间体，该中间体在碱性条件下水解后可以得到高纯度的psk。

3、工艺步骤主要包括以下内容：步骤1，合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh或者tyr-ile-tyr-thr-oh。步骤2，将步骤1中所得到的多肽上酚羟基进行定点修饰得到tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh或者tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh。步骤3：水解步骤2所得化合物得到psk-α[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh]或者psk-β[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh]。

4、采用固相方法合成多肽tyr-ile-tyr-thr-gln-oh或者tyr-ile-tyr-thr-oh，以wang树脂或者ctc树脂作为起始树脂，固相树脂取代度为0.3-1.3mmol/g；缩合试剂的使用，为dic、dcc、hbtu、hatu、pybop、pyaop、tbtu，所采用的碱为nmm、diea、tea；选择tfa为多肽裂解溶剂，清除剂选择水、tes、tis、edt、dodt中的一种或任意组合。

5、采用固相合成方法时，所使用的氨基酸为：

6、①合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh所选用的保护氨基酸分别为fmoc-gln(trt)-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-tyr(r)-oh,fmoc-ile-oh,p1-tyr(r)-oh,其中r为tbu或者h，p1为boc或者fmoc；

7、②合成tyr-ile-tyr-thr-oh所选用的保护氨基酸分别为fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-tyr(r)-oh,fmoc-ile-oh,p1-tyr(r)-oh,其中r为tbu或者h，p1为boc或者fmoc；

8、选择液相法来合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh，采用逐步法或者片段法，其特征为：逐步法采用h-gln(trt)-otbu作为起始原料，从右往左连接；片段法采用1+4，2+3，3+2，4+1的策略。选择液相法来合成tyr-ile-tyr-thr-oh，采用逐步法或者片段法，其特征为：逐步法采用h-thr(tbu)-otbu作为起始原料，从右往左连接；片段法采用1+3，2+2，3+1的策略。

9、步骤2中专一性酚羟基酰氟化试剂为so2f2，tyr-ile-tyr-thr-gln-oh转化为tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh，tyr-ile-tyr-thr-oh转化为tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh。

10、磺酰氟化溶剂为水、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或者几种混合物。碱为硼砂、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、氨水、氢氧化钠、dmap、pbs、tea、nmm、diea其中的一种或者几种混合物。碱摩尔当量为多肽的2-5倍，溶剂与反应原料的体积质量比为5-20:1。

11、合成psk-α[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh]或者psk-β[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh]所用的试剂为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、dbu或者碳酸锂，所用的溶剂为乙二醇或者丙二醇，碱摩尔当量为多肽的2-5倍，溶剂与反应原料的体积质量比为3-10:1。

12、用高效液相色谱法进行纯化，选用c8或者c18做为色谱柱填料，选用醋酸作为流动相介质。

13、整个反应的中间控制可以采用树脂茚三酮显色法、tlc茚三酮显色法或者hplc方法。

14、本发明通过现有工业上最常用的保护氨基酸来合成多肽后，利用易得的so2f2气体对多肽上的特定羟基进行专一化磺酰氟化反应，反应后过量的气体不会在反应液中残留，反应由一种物质完全转化为另外一种物质，再利用常见的碱和环境友好的试剂将磺酰氟化的中间体进行水解得到产物，整个工艺条件温和，能够有效的避免磺化多肽生长因子在酸性条件下特别是浓tfa条件下不稳定的问题。整个反应转化率高，原料易得，使得整个工艺的成本很低，反应条件温和，非常有利于产业化。