miRNA及其相关生物材料在调控丹参中丹参酮和丹酚酸含量中的应用

本发明涉及mirna及其相关生物材料在调控丹参中丹参酮和丹酚酸含量中的应用。

背景技术：

1、丹参(salvia miltiorrhiza bunge)为唇形科(lamiaceae)鼠尾草属(salvia)多年生草本植物，主要以干燥的根及根茎入药，是中国传统医学常用的大宗类中药材之一，也是中国药典一直收录的主要品种，具有重要的经济和药用价值。临床上主要用于治疗心脑血管疾病。丹参的主要药效成分为丹参酮和水溶性丹酚酸类化合物，药典规定丹参中丹参酮类化合物的含量不得低于0.2％，丹酚酸类化合物含量不得低于3.0％。

2、目前关于丹参主要药效成分丹参酮类及丹参酚酸类化合物的生物合成途径已研究较为清楚，丹参酮合成途径主要包括三个阶段：第一阶段主要合成所有萜类化合物的前体，一方面通过发生在细胞质或过氧化物酶体的甲羟戊酸途径(mva)途径将3-磷酸甘油醛(g3p)和丙酮酸经dxs、dxr、mct、cmk、mds、hds、hdr七种酶的催化合成异戊烯基焦磷酸(ipp)；另一方面通过发生在质体中的甲基赤藓糖醇磷酸途径(mep)途径将两分子乙酰辅酶a(acetyl-coa)经6种关键酶aact、hmgs、hmgr、mk、pmk、mdc作用后合成二甲基丙烯基焦磷酸(dmapp)(ma et al,2012)。第二阶段是丹参酮骨架合成。首先，萜类化合物前体ipp和dmapp经gpps、fpps、ffpps催化生成丹参酮的焦磷酸氢盐前体物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)。接着ggpp经cps和ksl催化转变为丹参酮骨架次丹参酮二烯(miltiradiene)。第三阶段是丹参酮骨架的修饰，包括氧化、甲基化、环化及脱羧反应等，参与这类催化的主要为细胞色素p450单加氧酶。目前鉴定到的包括cyp76ah1、cyp76ah3、cyp76ak3、cyp71d411、cyp71d464和cyp71d375等。丹参酚酸类化合物的合成包括苯丙烷代谢途径和酪氨酸代谢途径。苯丙烷代谢途径中，l-苯丙氨酸经过pal、c4h和4cl三种酶的依次催化，转变为对香豆酰辅酶a(4-coumaroyl-coa)；在酪氨酸途径中，l-酪氨酸经tat等酶催化生成dhpl(丹参素)。之后，对香豆酰辅酶a和丹参素经迷迭香酸合酶ras和p450酶cyp98a14的催化生成迷迭香酸(ra)。随后，两分子迷迭香酸聚合成为丹酚酸e，丹酚酸e进一步被催化成丹酚酸b。

3、mirna是一类长约21nt的内源性小分子单链非编码rna，在植物中mirna通过在转录或转录后水平调控一系列功能各异的转录因子或蛋白序列，从而在植物生长发育、胁迫响应、初生/次生代谢产物生物合成等过程中行使重要作用。目前，mirna与次生代谢物合成的关系研究较少，在丹参中解析mirna对丹参酮，丹酚酸合成的影响具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控丹参中丹酚酸、丹酚酸前体和/或丹参酮的含量。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了mirna的下述任一种应用：

3、h1、在调控丹参中丹酚酸或丹酚酸前体的合成和/或丹参酮的合成中的应用，

4、h2、在调控丹参中丹酚酸或丹酚酸前体的含量和/或丹参酮含量中的应用，

5、h3、在制备调控丹参中丹酚酸或丹酚酸前体的合成和/或丹参酮合成的产品中的应用，

6、h4、在开发和/或制备丹参相关药物中的应用，

7、h5、在制备丹参育种材料中的应用；

8、所述mirna可为如下的mirna：

9、a1)对应的基因组序列为序列表中序列1；

10、a2)对应的基因组序列为序列表中序列2；

11、a3)对应的基因组序列为序列表中序列3。

12、本发明中，所述调控可为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。

13、上述应用中，所述丹酚酸可为丹酚酸b(sab)。所述丹酚酸前体可为迷迭香酸(ra)和/或丹参素(ds)。所述丹参酮可为隐丹参酮(ct)、二氢丹参酮ⅰ(dt-ⅰ)、丹参酮iia(taii)和/或丹参酮i(tai)。

14、为了解决上述技术问题，本发明还提供了调控上文所述mirna表达、含量或活性的物质的下述任一种应用：

15、h1、在调控丹参中丹酚酸或丹酚酸前体合成和/或丹参酮合成中的应用，

16、h2、在调控丹参中丹酚酸或丹酚酸前体含量和/或丹参酮含量中的应用，

17、h3、在制备调控丹参中丹酚酸或丹酚酸前体合成和/或丹参酮合成的产品中的应用，

18、h4、在开发和/或制备丹参相关药物中的应用，

19、h5、在制备丹参育种材料中的应用。

20、上述应用中，所述物质可为下述任一种生物材料：

21、b1)编码所述mirna的基因或编码所述mirna的前体的基因，所述前体为pre-mir858a、pre-mir858b或pre-mir858c；

22、所述mir858a对应的基因组核苷酸序列为序列表中序列1，所述mir858b对应的基因组序列为序列表中序列2，所述mir858c对应的基因组序列为序列表中序列3；

23、b2)含有b1)所述基因的表达盒；

24、b3)含有b1)所述基因的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

25、b4)含有b1)所述基因的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

26、b5)含有b1)所述基因的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

27、b6)含有b1)所述基因的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

28、b7)含有b1)所述基因的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。

29、上述应用中，所述丹酚酸可为丹酚酸b(sab)。所述丹酚酸前体可为迷迭香酸(ra)和丹参素(ds)。所述丹参酮可为隐丹参酮(ct)、二氢丹参酮ⅰ(dt-ⅰ)、丹参酮iia(taⅱ)和/或丹参酮i(taⅰ)。

30、为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种调控丹参中丹酚酸含量和/或丹参酮含量的方法，包括调控丹参中上文所述mirna基因表达量或/和所述mirna的前体的基因表达量或/和所述mirna的含量或/和所述mirna的前体的含量，从而调控丹参中丹酚酸含量和/或丹参酮含量。

31、上文所述的mirna也属于本发明的保护范围。

32、上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。

33、本发明在丹参中分离鉴定了smi-mir858并解析了功能。

34、对丹参mirna组数据进行分析，发现丹参中存在三个smi-mir858序列，分别命名为smi-mir858a，smi-mir858b，smi-mir858c(序列见图1).使用tapir和psrnatarget软件预测smi-mir858s的靶基因，结果发现smi-mir858s共有11个靶基因。其中，smmyb111能够被3个smi-mir858识别，smmyb6,smmyb88,smmyb97和smil_00003526仅能被smi-mir858a识别，另外6个则能被smi-mir858a或smi-mir858b识别。

35、为了进一步确定smi-mir858s的靶基因，本发明对降解组数据进行了分析，结果发现：smmyb6 smmyb97 smmyb111和smil_00003526(命名为smmyb112)都能被smi-mir858识别并切割的识别。因smi-mir858a能识别并切割全部上述四个靶基因，因而选取其进行下一步研究。

36、构建smi-mir858a过表达载体，转化丹参野生型。荧光定量pcr检测smi-mir858a表达量与野生型相比出现明显上调，表型观察发现转基因植株出现了植株变矮的表型。在过表达植株中检测smmyb6 smmyb97 smmyb111和smmyb112表达量降低，进一步证明这四个smmyb基因为smi-mir858a的靶基因。

37、对过表达材料进行代谢组组分析，发现过表达材料中，丹酚酸途径的丹酚酸b和迷迭香酸的含量与野生型相比分别降低了78.0％和94.9％。丹参酮途径中分别降低了：隐丹参酮63.5％，二氢丹参酮ⅰ53.9％，丹参酮iia54.9％，丹参酮i 62.9％，表明smi-mir858a过表达抑制了丹参酮和丹酚酸的合成。

38、对3个月的转基因和野生型丹参根部材料进行转录组测序分析，发现过表达植株中丹酚酸和丹参酮途径途径中主要合成基因均出现明显下调。

39、先前已有研究表明：在丹参中，smmyb97调控丹参酮和丹酚酸的合成，smmyb111调控丹酚酸的合成。且本发明利用酵母单杂交实验证明smmyb6和smmyb112均能够结合到丹酚酸合成通路的smpal1和smtat1基因启动子区，同时能够结合到丹参酮合成通路的smksl1和smcps1启动子区。进一步通过烟草瞬时转化实验发现通过实验证明smmyb6和smmyb112能够激活smpal1，smtat1，smksl1和smcps1的表达，且该激活活性能够被smi-mir858a抑制，表明在丹参中smi-mir858a能够参与丹参酮和丹酚酸的合成。