一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的试剂盒

本发明属于分子育种。更具体地，涉及一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的试剂盒。

背景技术：

1、牛奶是一种营养元素丰富的“天然饮料”，随着生活水平的提高，人们对于牛乳等高蛋白营养物质的需求量正在稳步上升，在19世纪末引入产奶量高的荷斯坦牛，与本土黄牛杂交培育出中国荷斯坦牛。在多世代的选育过程中，中国荷斯坦牛逐步形成了遗传稳定和适应性强的优质的奶牛品种。

2、我国对乳制品消费呈健康化和多元化态势，牛奶作为最常见的乳制品之一且营养价值丰富，消费者对牛乳的品质要求越来越高。目前我国奶业与其他畜牧业发达国家相比存在很大的进步空间，而奶牛生产性能测定(dairy herd improvement，dhi)为我国奶牛的优良育种工作提供技术支撑，进而改善奶牛的泌乳性能。奶牛泌乳性能的评价指标包括产奶量、乳脂率、乳糖率、乳蛋白率、干物质、体细胞数、尿素氮、校正奶等。

3、乳脂肪是衡量乳品质的重要指标，是牛奶的主要成分之一，是一种天然高质量的脂肪，乳脂肪在牛奶的含量一般为3％～8％之间。乳脂肪是由甘油三酯、磷脂和胆固醇等构成的混合物，以乳脂肪球的形态存在。乳脂中富含多种矿物元素、脂溶性维生素和共轭亚油酸等，不仅能够提供人体所必需的能量和营养，还具有增加免疫力、降低胆固醇、抗氧化、调高骨密度等的功能，在维持血脂平衡，神经发育和心血管健康等方面有着重要意义。

4、干物质对奶牛的生长和生产十分重要。干物质是作为水之外的所有营养因素的载体，采食更多的干物质就意味着更多的营养摄入；干物质采食量是大多数奶牛场的第一限制性营养因素。奶牛干物质摄入量的多少与日产奶量和牛奶中干物质的含量(特别是乳蛋白率和乳脂率的高低)有关。随着泌乳阶段的不同，干物质采食量达不到预期的数量，还会对牛体的健康带来一定的危害。

5、体细胞(somatic cell count，scc)主要是白细胞和乳房分泌组织的上皮细胞。白细胞具有抗疾病感染和协助修复损伤组织的防御功能。体细胞数是衡量牛奶中微生物状况的一个重要指标。体细胞计数是乳房健康的指示性指标，乳房的健康程度与奶牛的产奶性能有关。

6、校正奶量(htacm)是将测定日奶量按泌乳天数及乳脂率校正的数值。用于比较不同生理阶段牛群及个体之间产奶量高低的指标。在实际生产中，多数母牛的泌乳天数和胎次不同，且母牛在泌乳高峰期及泌乳后期产奶量差距很大，在不同的泌乳阶段，产奶量也不同，因此很难用同一标准来评估奶牛个体泌乳性能。而校正奶量可以使处在不同泌乳阶段及不同乳脂率的泌乳牛，在同一标准下进行比较。

7、溶血磷脂酸受体-1(lysophosphatidic acid receptor 1，lpar1)是溶血磷脂酸受体家族(lysophosphatidic acid receptors，lpars)的一员，参与调控溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，lpa)的生物学活性。lpar1与lpa的亲和力最高，lpa的大部分生物学功能是通过lpar1执行。lapr1与lpa结合后，通过g蛋白引起下游信号通路的激活，参与细胞增殖、生长、迁移、ca2+动员、细胞骨架改变等多种生理反应。当前对lpar1基因相关功能的研究主要针对人和鼠方面，而对于在畜牧产业占据重要地位的奶牛的相关研究还比较少，本研究结果将会为lpar1基因在中国荷斯坦牛乳品质性状的分子育种上应用。

8、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(pcr-rflp)又称为caps(cleavedamplification polymorphism sequence-tagged sites)，是pcr技术和核酸限制性酶切技术相结合而产生的一种分子鉴定技术。通过选用适当的限制性内切酶对相同长度的pcr产物进行酶切，得到不同的酶切片段，再通过凝胶电泳加以区分，达到鉴定和鉴别物种的目的，尤其在物种的鉴别和基因分型得到了大量应用。将pcr与rflp技术结合建立一种适用于snps位点基因分型的快速鉴定方法。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的试剂盒。

2、本发明的第一目的是提供检测中国荷斯坦牛的snp位点的基因型的试剂在评估其乳品质性状和/或制备评估其乳品质性状的试剂盒中的应用。

3、本发明的第二目的是提供一种用于评估中国荷斯坦牛乳品质性状的组合物。

4、本发明的第三目的是提供一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的试剂盒。

5、本发明的第四目的是提供一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的方法。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、本发明通过pcr扩增中国荷斯坦牛lpar1基因，找出其snps位点中的差异限制性内切酶，应用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再将酶切产物进行电泳，根据图谱进行基因型鉴定。

8、具体地，本发明以123头中国荷斯坦牛的基因组dna为模板，使用pcr技术扩增lpar1基因，通过测序和pcr-rflp的方法进行snps的筛选及基因型的鉴定，分析lpar1基因单核苷酸多态性位点在群体中的遗传效应，并探究lpar1基因多态性与中国荷斯坦牛乳品质性状的相关关系。在中国荷斯坦牛群体中发现了lpar1基因在外显子1和外显子4上存在两个snp位点：

9、snp位点1位于第1外显子上的第179个碱基处，a突变成为g，即e1-179 a>g，位于nc_037335.1：100492406(即ars-ucd1.2版牛基因组的8号染色体的第100492406核苷酸)，其不同基因型与中国荷斯坦牛乳汁的脂肪含量(％)、干物质含量(％)和体细胞数量(万个/ml)，呈显著相关关系(p<0.05)，其中基因型为gg的奶牛个体乳汁中的脂肪含量(％)、干物质含量(％)显著高于基因型为aa和ag的奶牛个体乳汁中的脂肪含量(％)、干物质含量(％)，其个体体细胞数量(万个/ml)的指标显著高于基因型ag奶牛个体乳汁中体细胞数量(万个/ml)。

10、snp位点2位于第4外显子上的第522个碱基处，g突变成为a，即e4-552 g>a，位于nc_037335.1：100419289(即ars-ucd1.2版牛基因组的8号染色体的第100419289核苷酸，发现该位点不同基因型与校正奶量(kg)成显著关系(p<0.05)，其中基因型为gg的奶牛个体的校正奶量(kg)显著高于基因型为ag的奶牛个体的校正奶量(kg)。

11、分子标记e1-179 a>g(snp位点1)中基因型gg，其奶牛个体乳汁中的脂肪含量(％)、干物质含量(％)的指标显著高于ag基因型和aa基因型，其奶牛个体乳汁中的体细胞数量显著高于基因型ag的奶牛个体；

12、分子标记e4-552 g>a(snp位点2)中基因型为gg的奶牛个体的校正奶量(kg)显著高于基因型为ag的奶牛个体。

13、因此本发明要求保护以下内容：

14、检测中国荷斯坦牛的snp位点的基因型的试剂在评估其乳品质性状和/或制备评估其乳品质性状的试剂盒中的应用，所述snp位点为：snp位点1和/或snp位点2；

15、所述snp位点1位于ars-ucd1.2版本nc_037335.1：100492406，存在三种基因型aa、ag和gg；

16、gg基因型个体乳品质性状的脂肪含量(％)显著高于aa或ag基因型个体；gg基因型个体乳品质性状的干物质含量(％)显著高于aa或ag基因型个体；gg基因型个体乳品质性状的体细胞数量(万个/ml)显著高于aa基因型个体。

17、所述snp位点2位于ars-ucd1.2版本nc_037335.1：100419289，存在三种基因型aa、ag和gg；

18、gg基因型个体乳品质性状的校正奶量(kg)显著高于ag基因型个体。

19、优选地，检测snp位点1的检测试剂为核苷酸序列seq id no:1～2所示的引物。

20、更优选地，检测snp位点1的检测试剂还包括bste ii酶。

21、优选地，检测snp位点2的检测试剂为核苷酸序列seq id no:3～4所示的引物。

22、更优选地，检测snp位点2的检测试剂还包括hae ii酶。

23、一种用于评估中国荷斯坦牛乳品质性状的组合物，所述组合物含有检测snp位点1和/或snp位点2的试剂，检测snp位点1的检测试剂为核苷酸序列seq id no:1～2所示的引物，检测snp位点2的检测试剂为核苷酸序列seq id no:3～4所示的引物。

24、上游序列:5'-acaaggctatgggctgaatc-3'(seq id no:1)；

25、下游序列:5'-cctgagttcttcccagattgc-3'(seq id no:2)；

26、上游序列:5'-ggccacatttaccatagaag-3'(seq id no:3)；

27、上游序列:5'-gctataaagatgccttgtcc-3'(seq id no:4)。

28、优选地，检测snp位点1的检测试剂还含有bste ii酶。

29、优选地，检测snp位点2的检测试剂还含有hae ii酶。

30、一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的试剂盒，含有任一所述的组合物。

31、优选地，还含有pcr试剂。

32、更优选地，所述pcr试剂为green taq mix

33、更优选地，还含有酶切试剂。

34、再更优选地，所述酶切试剂为rcutsmartbuffer(10×)。

35、作为一个具体的实施例，所述试剂盒含有核苷酸序列seq id no:1到4所示引物、green taq mix、ddh2o、bste ii酶、hae ii酶和rcutsmartbuffer(10×)，

36、其使用方法为：

37、1、待测奶牛个体的pcr扩增

38、核苷酸序列seq id no:1到4所示引物以中国荷斯坦牛个体血液基因组dna为模板，针对两个snp位点分别进行pcr扩增。

39、扩增体系为：green taq mix 10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、dna模板2.0μl、ddh2o 7μl，总体积20μl。

40、反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃45s、72℃1min，35个循环；72℃5min。

41、pcr产物使用1.5％琼脂糖电泳检测。电泳条件：120v、400ma、20min，于-20℃保存备用。

42、2、pcr-rflp基因分型

43、(1)对seq id no 1～2所示引物进行个体dna扩增的pcr扩增产物，使用限制性内切酶bste ii进行特异性酶切检测，在60℃的环境下进行酶切反应2h，酶切体系为：pcr产物6μl、bste ii酶0.2μl、rcutsmart buffer(10×)1μl、ddh2o 2.8μl，总体积10μl。

44、之后，使用1.5％琼脂糖凝胶检测，电泳条件为120v，20min。根据条带数目和长度确定个体基因型。

45、(2)对seq id no 3～4所示引物进行个体dna扩增的pcr扩增产物，使用限制性内切酶hae ii进行特异性酶切检测，在37℃的环境下进行酶切反应2h，酶切体系为：pcr产物6μl、hae ii酶0.2μl、rcutsmart buffer(10×)1μl、ddh2o 2.8μl，总体积10μl。

46、之后，使用1.5％琼脂糖凝胶检测，电泳条件为120v，20min。根据条带数目和长度确定个体基因型。

47、3、结果判读

48、针对snp位点1，存在三种基因型aa、ag、gg；gg基因型电泳结果显示为一条条带，长度为609bp；ag基因型电泳结果显示有三条条带，分别为609bp、465bp和144bp；aa基因型电泳结果显示有两条条带，分别为465bp和144bp。

49、针对该snp位点1，gg基因型个体乳品质性状的脂肪含量(％)显著高于aa或ag基因型个体；gg基因型个体乳品质性状的干物质含量(％)显著高于aa或ag基因型个体；gg基因型个体乳品质性状的体细胞数量(万个/ml)显著高于aa基因型个体。

50、针对snp位点2，存在三种基因型aa、ag、gg；aa基因型电泳结果显示为一条条带，长度为973bp；ag基因型电泳结果显示为三条条带，分别为973bp、655bp和318bp；gg基因型电泳结果显示为两条条带，分别为655bp和318bp。

51、针对该snp位点2，gg基因型个体乳品质性状的校正奶量(kg)显著高于ag基因型个体。

52、作为另一个具体的实施例，所述试剂盒含有核苷酸序列seq id no:1到4所示引物、green taq mix和ddh2o。

53、其使用方法为：

54、1、待测奶牛个体的pcr扩增

55、核苷酸序列seq id no:1到4所示引物以中国荷斯坦牛个体血液基因组dna为模板，针对两个snp位点分别进行pcr扩增。

56、扩增体系为：green taq mix 10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、dna模板2.0μl、ddh2o 7μl，总体积20μl。

57、反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃45s、72℃1min，35个循环；72℃5min。

58、pcr产物使用1.5％琼脂糖电泳检测。电泳条件：120v、400ma、20min，于-20℃保存备用。

59、pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测确定条带长度正确后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。采用seqman软件观察测序结果。

60、2、结果判读

61、针对snp位点1，位于扩增产物的465bp处，即lpar1基因的ars-ucd1.2版本nc_037335.1：100492406，即牛基因组的8号染色体的第100492406核苷酸，存在三种基因型aa、ag、gg。

62、针对该snp位点1，gg基因型个体乳品质性状的脂肪含量(％)显著高于aa或ag基因型个体；gg基因型个体乳品质性状的干物质含量(％)显著高于aa或ag基因型个体；gg基因型个体乳品质性状的体细胞数量(万个/ml)显著高于aa基因型个体。

63、针对snp位点2，位于扩增产物的655bp处，即lpar1基因的ars-ucd1.2版本nc_037335.1：100419289，即牛基因组的8号染色体的第100419289核苷酸，存在三种基因型aa、ag、gg。

64、针对该snp位点2，gg基因型个体乳品质性状的校正奶量(kg)显著高于ag基因型个体。

65、一种评估中国荷斯坦牛乳品质性状的方法，利用所述的组合物，检测所述snp位点的基因型。

66、作为具体的实施例，其方法同上文试剂盒具体实施例的使用方法。

67、本发明具有以下有益效果：

68、本发明以中国荷斯坦牛为对象，提供了影响中国荷斯坦牛乳品质性状的分子标记。pcr扩增lpar1基因的目的片段，采用pcr产物直接测序和pcr-rflp的方法对lpar1基因的遗传多态性进行检测，并分析lpar1基因snps与中国荷斯坦牛乳品质性状的相关性，为挖掘相关遗传标记在中国荷斯坦牛的分子标记辅助选择提供理论依据，进一步为中国荷斯坦牛乳品质性状分子育种提供新的基因资源。