一株可降解牛粪粪污的低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌筛选方法及应用

本发明涉及一株可降解牛粪粪污低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌筛选方法及应用对牛粪粪污进行低温降解的应用，属于微生物学领域，更具体的说，是涉及一株可降解牛粪粪污低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌筛选方法及应用。

背景技术：

1、牛粪中含有大量木质纤维素，由于东北地区低温期长，特定环境下存在特异性低温微生物群落，低温微生物是指在低温环境下具有生长繁殖能力的微生物群体，它们在各种低温的环境中生长繁殖，在自然界生物圈中存在非常丰富的低温微生物资源，因此将微生物资源充分的运用到生活、生产实践中，而低温微生物的生长、繁殖的温度一般在常温下就可以进行，无需使用其他能源，极易得到，分布的也较为广泛，因此人们开始致力于研究低温微生物，也受到了一些专家和学者的关注。目前为止，对于低温微生物的开发和利用上相对较少，从国内外的研究进展来看，仍然是研究中、高温微生物的居多，而且对于低温微生物降解菌的研究甚少。

2、迄今，国内外有记录报道的能够分泌木聚糖酶的微生物菌种多为一些真菌菌群，比如：木霉菌、曲霉菌等，低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌报道极少。

3、并且现阶段研究，且多存在生产成本高、产酶能力和产酶量不够高效稳定、ph适应范围狭窄等缺陷，因此有必要继续探寻和开发高活性、作用范围更广泛的新菌种，进一步拓展牛粪粪污降解新思路。低温菌，在节能和降低成本方面更具优势和潜力，极具开发前景。

4、总之，一株可降解牛粪粪污低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌筛选方法及应用尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明目的是针对上述问题，提供了一株可降解牛粪粪污低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌筛选方法及应用。

2、为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一株可降解牛粪粪污低温产木聚糖酶的韩国丛毛单胞菌，韩国丛毛单胞菌的分类名为comamonas koreensis，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，韩国丛毛单胞菌的保藏编号为cgmccno.26059，保藏日期为2022年11月07日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4、韩国丛毛单胞菌16srdna序列发表在genbank，登陆号为mhavgutb014，其16srdna序列为：

5、ctggcggcatgctttacacatgcaagtcgaacggtaacaggtcttcggatgctgacgagtggcgaacgggtgagtaacacatcggaacgtgcctagtagtgggggataactactcgaaagagtagctaataccgcatgagatctaaggatgaaagcaggggaccttcgggccttgcgctactagagcggctgatggcagattaggtagttggtgggataaaagcttaccaagccgacgatctgtagctggtctgagaggacgacnngccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggcgaaagnctgatccagcaatgccgcgtgcaggatgaaggccctcgggttgtaaactgcttttgtacggaacgaaaagacnttttctaataaagagggtccatgacggtaccgtaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttatgtaagacaaaaggtgaaatccccgggcttcaacctgggaacggcctttgtgactgcatagctagagtacggtagagggggatggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcaatcccctggacctgnactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcctaaacgatgtcaactggttgttgggaattaactttctcagtaacgaagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacccacctttgacatgtacggaagtgaccagagatggacatgtgctcgaaagagaaccgtaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgccattagttgctacgaaagggcactctaatgggactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttataggtggggctacacacgtcatacaatggctggtacaaagggttgccaacccgcgagggggagctaatcccataaagccagtcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagcgggtctcgccagaagtaggtagcctaaccgnaaggagggcgcttaccacggcggggttcgtgactggggtgaagtcgtaacaaggtagcc

6、韩国丛毛单胞菌生物学特征为:在lb培养基上为菌落较小，圆形，整齐，不透明，表面光滑，粘稠易挑取，具有典型的细菌菌落特征。

7、韩国丛毛单胞菌菌株的分离方法：

8、将采集的东北地区牛粪粪污样品5g加入装有50ml无菌水的150ml三角瓶中，120r/min震荡30min，吸取悬浊液1ml于盛有富集培养基的三角瓶中，在以15d为周期(15℃)培养箱中震荡120r/min培养，每15d按5％(v/v)接种量接种到新的富集培养基中，连续传代10次。

9、富集赫奇逊筛选培养基的组成为kh2po41.0g/l，nacl0.1g/l，fecl3·6h2o 0.01g/l，mgso4·7h2o 0.3g/l，nano32.5g/l，cacl2·6h2o 0.1g/l，木聚糖100～1000m g/l，余量为水；培养基的ph＝4.8～7.2。

10、韩国丛毛单胞菌菌株的筛选：

11、a.初筛：将富集培养液平板涂布，稀释倍数分别为10-8、10-9、10-10的样品溶液涂布到上述固体培养基上将培养皿放于15℃恒温培养箱中培养72h。将纯化后的菌株点种到木聚糖刚果红培养基上，15℃培养4d.根据水解圈直径(d)与菌落直径(d)比值(d/d)大小进行初步筛选。

12、b、复筛：将初筛菌株转接入液体培养基中，15℃下培养3天，液体培养发酵液3500r·min-1离心8min，上清液测定其木聚糖酶活力，进行复选。

13、本发明的优点是：

14、1、本发明通过在采集东北地区低温牛粪粪污，富集低温培养，筛选到低温高效降解牛粪粪污的微生物菌株，可在低温(15℃)下产生高效木聚糖酶，分解牛粪粪污，可用于东北低温冷凉地区畜禽粪污的发酵腐熟菌剂。

15、2、本发明的低温产木聚糖酶的菌株在规模化生产上具有很大的发展潜力。菌株不仅可以在低温条件下降解木质纤维素，并且可以有效转化牛粪中的养分，腐熟的有机肥施用在土壤中，还可以改良土壤肥力，培肥土壤。

16、3、本发明生产的腐熟菌剂产品具有独特的低温分解牛粪的特点，并且成本低廉，制备的有机肥施用后可以有效提高土壤有机质，促进种子出苗率，增强作物的抗旱、抗寒的能力。