一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用

本发明属于生物医疗，尤其涉及一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用。

背景技术：

1、骨缺损修复和骨骼再生一直是临床治疗难题，构建组织工程骨是实现骨重塑的重要手段。间充质干细胞是组织工程技术的种子细胞类型之一，在临床转化中具有很高的实用性。其作为一种低免疫原性的多能干细胞，具有多向分化和免疫调控等功能，是再生医学领域重要的细胞治疗策略。成体干细胞是来源于成人身体中已分化组织中的未分化细胞，来源组织包括骨髓、脂肪、神经和皮肤等。成体间充质干细胞多来源于受体自身，不产生免疫排斥，不引起瘤变，也不存在伦理争议，分离提取和增殖分化培养条件也相对简单，在器官组织修复及生理功能恢复上具有独特优势，是干细胞治疗手段中的重要种子细胞来源。

2、人源成体间充质干细胞的组织来源一直在不断被探索和开发中。目前研究报道用于骨再生的间充质干细胞主要是骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)和脂肪来源的间充质干细胞(at-msc)。bm-msc虽然成骨和成软骨效果显著，但需提取自体骨髓，组织获得难度大，手术创伤大，且体外培养的bm-msc增殖速率相对较慢，细胞倍增时间约为48小时，传代至第5/6代时出现分化和衰老的现象。at-msc的细胞增殖速度较好，倍增时间可缩短至约24小时，在传至第9/10代时仍维持干性表型，但由于存在表观遗传因素驱动的“组织记忆”效应，at-msc更容易分化为脂肪组织，成骨效果不稳定。因此，目前仍需进一步寻找和开发用于骨组织工程的成体间充质干细胞群。

3、近年来，在口腔种植学的上颌窦区骨再生领域，有关上颌窦黏膜成骨潜能及其来源的间充质干细胞的研究引起了学者的广泛关注。上颌窦黏膜组织结构如图1所示，在模拟上颌窦底提升手术模型的体内实验中观察到，将上颌窦黏膜从窦底骨壁上剥离抬高，并利用种植体维持二者的空间距离，经过愈合周期，紧邻黏膜下方有新骨形成，说明了上颌窦黏膜具有成骨潜力。与此同时，在体外研究中将成人上颌窦黏膜离体培养，所获得的细胞经传代纯化后，表达间充质干细胞相关表面标志物，表达率在90％以上，且该细胞具备自我更新和多向分化能力。由此，上颌窦黏膜来源间充质干细胞被确认存在，并猜测上颌窦黏膜的成骨潜能来源于其中的间充质干细胞的增殖和分化。

4、上颌窦黏膜具有解剖位置特殊性，其贴附骨组织而存在，具备骨膜特性，同时临床发现，上颌窦黏膜具有较强的自修复性，说明其中含有的干细胞群增殖速度较快。如此一来，上颌窦黏膜来源的间充质干细胞兼备了细胞增殖速度快和可成骨分化的双重优势，可弥补单一应用bm-msc和at-msc的不足。由于上颌窦黏膜易于取下进行离体细胞培养，且取出部分黏膜基本不会对人体健康造成负面影响，在短期内黏膜可自愈合和再生，因此，从上颌窦黏膜中获取的间充质干细胞有望成为一种新的人类成体间充质干细胞供源，不仅可以开发其用于牙槽骨等口腔内组织再生的工程技术之中，甚至还可能将其作为诱导全身其他部位骨骼再生的重要种子干细胞。

5、目前，人源上颌窦黏膜来源的间充质干细胞虽然已被提取和鉴定，但实施技术并不成熟，未建立标准化的分离培养流程。上颌窦黏膜存在解剖位置的特殊性，这使得其结构复杂，层次多样，现有研究中并未依据黏膜的亚层结构逐一分离并进行细胞提纯和培养，且培养方法各异，导致所获得的细胞群体存在异质性，因此对这一来源的细胞的命名和认知也各有差异，影响了其在骨组织工程领域的应用。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明实施例是这样实现的，一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法，包括以下具体步骤：

3、步骤1、细胞提取：

4、步骤1.1、将获得的上颌窦黏膜全层组织浸泡于含10％青霉素-链霉素(hyclone)的预冷生理盐水中，浸泡30min；细胞提取过程全程无菌、冰上操作，将黏膜转移至无额外添加的α-mem培养基中(biosharp)，使其完全舒展，骨膜层组织面向上，利用眼科镊将少部分余留的骨膜层剥离，使撕脱后的组织面充分暴露血管，余留的组织为固有层及上皮层，将黏膜彻底清洗去除血液；将骨膜层进行组织贴壁培养，作为对照；

5、步骤1.2、采用中性蛋白酶dispaseⅱ(solarbio)消化剩余上颌窦黏膜组织，即固有层和上皮层，dispaseⅱ消化液利用hepes缓冲液配置成1u/ml，并用孔径为0.22μm的过滤膜除菌；每5mm*5mm的组织块用1ml的dispaseⅱ消化液37℃孵育，每10分钟颠倒混匀一次；

6、步骤1.3、消化1.5小时后，取出黏膜剩余组织，即固有层，用生理盐水清洗3次，每次液体体积为1ml，将消化液和用于清洗的生理盐水一并离心，程序为300g，5min，并进行细胞培养，作为对照；

7、步骤1.4、组织彻底清洗后，利用眼科镊将整块组织分离至约9mm2大小，在tc处理的t25培养瓶(whb)中进行组织块贴壁培养，每瓶放置4-6枚组织块，完全培养液使用α-mem(biosharp)，10％胎牛血清(procell)，1％青霉素-链霉素(hyclone)；

8、步骤1.5、保证培养瓶不受外力移动，37℃，5％co2孵箱中静置培养72小时后，进行半量换液，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代；

9、步骤2、传代：

10、步骤3、细胞的冻存和复苏。

11、进一步的技术方案，在所述步骤1.2中，hepes缓冲液的成份为n-2-羟乙基-哌嗪基-n-2-乙基磺酸的兼性离子缓冲液。

12、进一步的技术方案，所述步骤2包括以下具体步骤：

13、使用0.25％胰蛋白酶溶液(hyclone)消化细胞，时间为3min，待细胞完全变圆后，使用2倍胰蛋白酶体积的含10％胎牛血清的α-mem培养液终止消化，吹打瓶底，使细胞完全脱离培养瓶悬浮在液体中，将液体完全移入离心管中；将原培养瓶用生理盐水轻柔清洗2次，每次用量为2ml，并将清洗后的液体一并移入离心管中，以完全清除消化后悬浮的单细胞；将移至离心管的细胞悬液离心，程序为300g，5min，重悬，按照细胞融合度50％-60％接种。

14、进一步的技术方案，所述步骤3中的细胞冻存包括以下步骤：

15、去除步骤2中离心后的上清液，留细胞沉淀，加入细胞冻存液，配比为92％dmso和8％胎牛血清，使用梯度冻存法保存细胞，程序为4℃，30min；-20℃，30min；-80℃，过夜；液氮，长期储存。

16、进一步的技术方案，所述步骤3中的细胞复苏包括以下步骤：

17、冻存细胞从液氮取出后，立即放至37℃水浴至刚好完全融化，将该液体与单纯α-mem培养基以1:9的比例混合，离心，程序为300g，5min，去净上清液，加入完全培养基重悬细胞，按照细胞融合度60％-70％接种；第二天，全量换液一次，之后每2-3天全量换液，至细胞融合度达到80％-90％进行传代。

18、本发明实施例的另一目的在于，一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的应用，基于上述人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法制备的人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞，将所述人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞应用于细胞骨组织工程中。

19、本发明实施例提供的一种人上颌窦黏膜固有层间充质干细胞的提纯方法及应用，发现并提取培养了人源上颌窦黏膜固有层间充质干细胞，黏膜单一亚层体外培养，区别于目前将上颌窦黏膜全层进行体外培养，解决现有上颌窦黏膜间充质干细胞的来源混杂、提纯困难的问题。并将所获得的上颌窦黏膜固有层间充质干细胞进行了成骨功能验证，证明其可以成骨分化，证实其在骨再生组织工程技术环节中的应用价值。