卟啉化合物的高产策略及其应用

本发明属于生物工程和发酵工程领域，更具体地，本发明涉及一种卟啉化合物的高产策略及其应用。

背景技术：

1、卟啉化合物(porphyrins)广泛存在于自然界中，它由四个吡咯亚基组成，相邻亚基之间由亚甲基桥连并环化形成卟啉大环分子。卟啉类化合物对维持植物和哺乳动物的生命至关重要。吡咯环上的8个β位和卟啉环内部的4个氢原子都可被其他基团取代，从而形成卟啉衍生物。

2、

3、大多数卟啉化合物都以金属化的卟啉大环分子存在，当其与脱辅基蛋白(apoprotein)结合时，在光捕获、电子传递和氧气结合等方面发挥重要作用。自然界中卟啉化合物包括血红素、叶绿素(chlorophyll，chl)、细菌叶绿素(bacteriochlorophyll，bchl)、维生素b12(vitamin b12，vb12)、西罗血红素(siroheme)、辅酶f430和血红素d1等，在生物体的生命活动中承担着重要的作用。

4、卟啉化合物可以从含有卟啉一些自然界的天然物质中通过提取、分离、纯化等方法得到的。目前本领域中，有两种途径得到目标卟啉分子：天然卟啉的结构修饰和卟啉化合物的全合成。天然卟啉的结构修饰虽然能很方便地进行结构的改造，但是受到结构本身的限制，同时外环官能基团的选择上也十分有限，此外，也限制了卟啉化合物的本身生理活性。因此，通常人们需要通过全合成的办法，来获得具有特定生理活性和功能的卟啉分子。

5、以往的技术中，一些合成卟啉类化合物的方法包括rothemund法、adler法、lindesy法、微波激励法等。rothemund法以醛类化合物和吡咯为原料、以吡啶和甲醇为溶剂在风口的玻璃管中反应、90-95℃水浴中反应30min将反应液降温后过滤，获取滤液后取出甲醇、真空浓缩，导入醚中、过滤后洗涤，用盐酸、乙酸钠、氢氧化钠以及硫酸钠用willstatter法浓缩、使卟吩析出。adler法为rothemund法基础上的改进，也是一种依托于多步骤的化学反应的方法。

6、综上，本领域亟待进一步探索优化的生物合成制备卟啉类化合物的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种及卟啉化合物的高产策略及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种高产卟啉化合物的发酵方法，包括：发酵培养卟啉化合物生产菌，从而产生卟啉化合物；其中，在发酵起始前或发酵过程中，添加选自下组的添加成分：5-氨基乙酰丙酸(5-ala)、葡萄糖、谷氨酸盐、琥珀酸，或它们的组合。

3、在一种或多种优选实施方式中，所述添加成分为5-氨基乙酰丙酸；所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为0.5～5g/l，较佳地1～4g/l(如2或3g/l)，更佳地1.5～2.5g/l(最佳地为2±0.2g/l)。

4、在一种或多种优选实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸添加于初始的发酵培养基中。

5、在一种或多种优选实施方式中，初始培养基中包括葡萄糖的同时，在发酵至30～42小时、较佳地32～40小时(如34、35、36、37、38、39小时)的阶段补加葡萄糖；较佳地，还在发酵至55～70小时(更佳地58～68小时，如60、62、64、66小时)的阶段补加葡萄糖。

6、在一种或多种优选实施方式中，所述葡萄糖的添加量为5～20g/l，较佳地7～15g/l(如8、9、10、11、12或13g/l)，更佳地10±2g/l(最佳地为10±1g/l)。

7、在一种或多种优选实施方式中，所述添加成分为谷氨酸盐；所述谷氨酸盐的添加量为5～20g/l，较佳地7～15g/l(如8、9、10、11、12或13g/l)，更佳地10±2g/l(最佳地为10±1g/l)。

8、在一种或多种优选实施方式中，所述谷氨酸盐添加于初始的发酵培养基中。

9、在一种或多种优选实施方式中，所述谷氨酸盐包括：谷氨酸钠，谷氨酰胺和l-谷氨酸盐酸盐。

10、在一种或多种优选实施方式中，所述添加成分为琥珀酸；所述琥珀酸的添加量为5～20g/l，较佳地7～15g/l(如8、9、10、11、12或13g/l)，更佳地10±2g/l(最佳地为10±1g/l)。

11、在一种或多种优选实施方式中，所述琥珀酸添加于初始的发酵培养基中。

12、在一种或多种优选实施方式中，所述添加成分为5-氨基乙酰丙酸和谷氨酸盐。

13、在一种或多种优选实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为0.3～4g/l，较佳地0.5～3g/l(如1、1.5、2或2.5g/l)，更佳地0.6～2g/l(最佳地为1±0.3g/l或1±0.2g/l)。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述谷氨酸盐的添加量为所述谷氨酸盐的添加量为5～20g/l，较佳地7～15g/l(如8、9、10、11、12或13g/l)，更佳地10±2g/l(最佳地为10±1g/l)。

15、在一种或多种优选实施方式中，所述谷氨酸盐添加于初始的发酵培养基中。

16、在一种或多种优选实施方式中，所述谷氨酸盐包括：谷氨酸钠，谷氨酰胺和l-谷氨酸盐酸盐。

17、在一种或多种优选实施方式中，发酵培养的培养基包括：葡萄糖、酶解玉米浆、味精、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、碳酸钙。

18、在一种或多种优选实施方式中，所述培养基包括：

19、葡萄糖： 20～40重量份，较佳地25～35重量份，如30重量份；

20、酶解玉米浆：2～4重量份， 较佳地2.5～3.5重量份，如3重量份；

21、味精： 2～4重量份， 较佳地2.5～3.5重量份，如3重量份；

22、磷酸氢二钾：1～2重量份， 较佳地1.2～1.8重量份，如1.5重量份；

23、硫酸镁： 7～14重量份，较佳地8～12重量份，如10重量份；

24、氯化钠： 1.5～2.5重量份，较佳地1.8～2.2重量份，如2重量份；

25、碳酸钙： 7～14重量份，较佳地8～12重量份，如10重量份。

26、在一种或多种实施方式中，所述的发酵方法为规模化(包括大于摇瓶的规模，如小规模(小试)、中规模(中试)、大规模)的方法。例如，所述发酵方法在≥100ml、≥200ml、≥250ml、≥300ml、≥500ml、≥1l、≥2l、≥3l、≥5l、≥7l、≥10l、≥20l、≥30l、≥50l、≥100l的生物反应器中进行。

27、在本发明的另一方面，提供前面任一所述方法的应用，用于：制备卟啉化合物；或提高卟啉化合物生产菌的卟啉化合物的产量；或提高卟啉化合物生产菌生产卟啉化合物的转化率；或缩短卟啉化合物生产菌生产卟啉化合物的发酵周期。

28、在一种或多种优选实施方式中，所述的卟啉化合物生产菌包括选自下组的菌：光合细菌、脱氮副球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌、中美根瘤菌、巴克利氏甲烷杆菌。

29、在一种或多种优选实施方式中，所述光合细菌包括选自下组的菌：类球红细菌、荚膜红细菌、大肠杆菌、固氮红杆菌或胶状红长命菌。

30、在一种或多种优选实施方式中，所述卟啉化合物生产菌为fnrl被下调(如缺失，形成δfnrl)的菌株。

31、在一种或多种优选实施方式中，所述的卟啉化合物包括(但不限于)：粪卟啉iii或其螯合物、类似物、衍生物或下游产物(如铁粪卟啉iii)。

32、在本发明的另一方面，提供5-氨基乙酰丙酸(5-ala)、葡萄糖、谷氨酸盐、琥珀酸，或它们的组合的应用，用于：提高卟啉化合物生产菌的卟啉化合物的产量；或，提高卟啉化合物生产菌生产卟啉化合物的转化率。

33、在一种或多种优选实施方式中，所述组合为5-氨基乙酰丙酸与谷氨酸盐的组合；更佳地，按照质量体积比，5-氨基乙酰丙酸:谷氨酸盐为1:(2-50)。

34、在一种或多种优选实施方式中，所述组合为5-氨基乙酰丙酸与谷氨酸盐的组合；按照质量体积比，5-氨基乙酰丙酸:谷氨酸盐为1:(3-40)，较佳地1:(4-30)，更佳地1:(5-25)，更佳地1:(6-20)，更佳地1:(7-18)，更加地1:(8-15)，更佳地1:(9-12)，具体如1:10。

35、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。