LTA4H基因或蛋白为靶点在筛选抑制口蹄疫病毒复制的药物中的应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种lta4h基因或蛋白为靶点在筛选抑制口蹄疫病毒复制的药物中的应用。

背景技术：

1、口蹄疫(foot and mouth disease，fmd)是一种严重的、高度传染性的全球家畜病毒性疾病，主要影响家畜和野生偶蹄类动物，包括牛、猪、羊、山羊、骆驼和鹿。由一种小核糖核酸科病毒引起，即口蹄疫病毒(fmdv)。在感染口蹄疫病毒(fmdv)后，随后的临床症状包括发烧、食欲不振、跛行，并在口腔、鼻、乳头和足部出现水泡性病。fmdv属于小rna病毒科，口蹄疫病毒属，是一种小型、非包膜病毒，包含一个约8500个碱基的单链正义rna基因组，周围是一个二十面体的衣壳蛋白，四种结构蛋白vp1–4各有60个拷贝。该病毒抗原高度可变，由七个血清型组成，包括o型、a型、c型、亚洲1型、南非地区(sat)1型、sat2型和sat3型，每个血清型中又有多个亚型。这七种血清型之间存在约60-70％的同源性，不同血清型之间和不同亚型之间几乎没有交叉保护,同一血清型内的不同亚型或分离株发生交叉免疫的程度均不相同，因此，该病被国际兽疫局视为最具传染性的猪病。

2、基因编辑技术是通过分子生物学方法对各类细胞中基因进行定向、精准的突变、修饰或编辑的技术。该技术已被广泛用于疾病治疗、抗病育种、遗传工程改造等研究领域。基因编辑技术不断发展成熟，从第一代的依赖锌指核酸酶zfn的编辑技术，第二代依赖转录激活样效应因子核酸酶talen的编辑技术，到第三代依赖成簇的规律性间隔的短回文重复序列cr ispr-cas9的编辑技术，历经发展近30年，已经取得了突破性的进展。

3、聚集的规则间隔短回文重复序列(crispr)-cas(crispr相关蛋白)系统最初在细菌和古菌中被发现，为细菌和古菌提供了适应性免疫反应，以抵抗噬菌体、质粒和转座子等移动遗传元件的入侵。其利用单一引导rna(sgrna)序列与基因组中的特定靶位点和cas9核酸内切酶结合。利用sgrna和靶dna序列之间的同源性，cas9核酸内切酶指向特定的靶位点，纠正、删除、添加或破坏基因，并永久修复致病突变。在预防或治疗多种疾病方面有着广泛的应用。这些系统已被重新用作非常强大的生物技术工具，用于细菌和真核生物系统中的基因编辑应用。该技术相比较其他技术更加便捷、高效、精准、稳定，而且相关使用成本费用更加低廉。为基因组定向改造、修饰、调控和应用等带来了突破性革命，在医学与生命科学各大领域具有广阔的应用前景。

4、白三烯a4水解酶(lta4h)是一种属于肽酶m1家族的蛋白质，特别是那些作用于醚键(醚水解酶)的蛋白质，是一种双功能含锌酶，且是重要的抗炎靶点,具有环氧化物水解酶活性和功能不明的氨基肽酶活性。作为环氧化物水解酶，lta4h催化环氧化物lta4水解为促炎物质二醇白三烯b4(ltb4)，其主要起化学引诱剂和炎症细胞激活剂的作用。作为一种氨基肽酶，lta4h可以处理与炎症和宿主防御相关的肽。lta4h参与花生四烯酸代谢，被贝斯塔丁抑制，并受到白三烯a4的自杀抑制，这是由于在tyr-379处形成共价加合物。有研究表明，lta4h在一些人类癌症中高度表达，包括食道腺癌、肺癌和甲状腺癌，并在动物模型中抑制肿瘤发生，具有深度的研究价值。

5、基于上述问题，本发明意外发现通过抑制或沉默宿主lta4h基因，能够抑制fmdv的复制，可作为靶点用于设计和筛选抑制fmdv复制的药物。基于此，为了进一步研究lta4h基因基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向lta4h基因基因的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向lta4h基因，结合crispr/cas9技术实现了lta4h基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系对fmdv具有抗性表型，能够显著抑制fmdv在细胞内的复制，为研究lta4h基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗fmdv的动物育种。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主lta4h基因/蛋白，能够抑制fmdv的复制，可作为靶点用于制备抑制fmdv复制的药物；其次，本发明提供了一种特异性靶向lta4h基因/蛋白的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向lta4h基因/蛋白，结合crispr-cas9技术实现了lta4h基因/蛋白的完全敲除，获得的单克隆细胞系对fmdv具有抗性表型，能够显著抑制fmdv在细胞内的复制，为进一步研究lta4h基因/蛋白在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种lta4h基因/蛋白为靶点在筛选用于预防或治疗口蹄疫病毒感染的药物中的应用；所述药物以lta4h基因/蛋白为靶点，抑制或沉默lta4h基因/蛋白的表达。

3、第二方面，本发明提供了一种lta4h基因/蛋白表达抑制剂在制备预防或治疗口蹄疫病毒感染的药物、药物组合物或疫苗组合物中的应用。

4、优选地，所述lta4h基因/蛋白表达抑制剂包括以lta4h基因/蛋白为靶点设计的小干扰rna；或所述lta4h基因/蛋白表达抑制剂包括靶向敲除lta4h基因/蛋白的sgrna。

5、优选地，所述sgrna包括lta4h-sgrna1和/或lta4h-sgrna2；

6、所述lta4h-sgrna1的靶向序列为：gcagcgtcgactttactcgc；

7、所述lta4h-sgrna2的靶向序列为：ttactcgccgggtactgacc。

8、优选地，所述lta4h-sgrna1由lta4h-sgrna1-f和lta4h-sgrna1-r退火形成的双链片段；所述lta4h-sgrna2由lta4h-sgrna2-f和lta4h-sgrna2-r退火形成的双链片段；

9、lta4h-sgrna1-f：5’-gcagcgtcgactttactcgc-3’：

10、lta4h-sgrna1-r：5’-gcgagtaaagtcgacgctgc-3’：

11、lta4h-sgrna2-f：5’-ttactcgccgggtactgacc-3’：

12、lta4h-sgrna2-r：5’-ggtcagtacccggcgagtaa-3’。

13、第三方面，本发明提供了一种lta4h基因功能缺失细胞系的构建方法，所述构建方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中lta4h基因功能缺失。

14、优选地，所述方法包括以下步骤：

15、(1)制备特异性靶向lta4h基因/蛋白的sgrna；

16、(2)将步骤(1)制备的sgrna寡聚核苷酸的双链片段插入到表达cas9的慢病毒载体的多克隆位点，转染细胞得到同时表达cas9蛋白基因和打靶sgrna序列的重组慢病毒；

17、(3)将步骤(2)制备的重组慢病毒转导宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得lta4h基因/蛋白功能缺失细胞系。

18、优选地，所述宿主细胞为pk-15细胞。

19、优选地，所述sgrna包括lta4h-sgrna1和/或lta4h-sgrna2；

20、所述lta4h-sgrna1的靶向序列为：gcagcgtcgactttactcgc；

21、所述lta4h-sgrna2的靶向序列为：ttactcgccgggtactgacc。

22、所述sgrna寡聚核苷酸的双链片段为：

23、lta4h-sgrna1-f：5’-gcagcgtcgactttactcgc-3’：

24、lta4h-sgrna1-r：5’-gcgagtaaagtcgacgctgc-3’：

25、lta4h-sgrna2-f：5’-ttactcgccgggtactgacc-3’：

26、lta4h-sgrna2-r：5’-ggtcagtacccggcgagtaa-3’。

27、第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述方法构建获得的lta4h基因功能缺失细胞系。

28、本发明的有益效果是：①本发明发现通过抑制或沉默宿主lta4h基因/蛋白，能够抑制fmdv的复制，可作为靶点用于制备抑制fmdv复制的药物；②本发明提供了一种靶向lta4h基因的sgrna，所述sgrna能够特异性靶向lta4h基因，结合crispr-cas9技术可实现宿主细胞中lta4h基因的敲除，打靶准确、敲除效率高；③本发明提供了一种通过crispr-cas9技术将所述sgrna转染于宿主细胞，构建lta4h基因/蛋白功能丧失细胞系的方法，通过使lta4h基因/蛋白功能丧失，获得的了具有fmdv抗性表型的细胞系，能够显著抑制fmdv的复制，为进一步研究pop基因/蛋白在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料，也可用于抗fmdv的动物育种，对未来预防或抑制fmdv感染提供一些理论依据，具有旷阔的应用前景。