一种麦角硫因核糖开关的筛选方法与流程

本发明涉及一种麦角硫因核糖开关的筛选方法，属于基因表达调控领域。

背景技术：

1、核糖开关(riboswitch)可通过特异性识别小分子配体，并在无需蛋白质辅助的情况下，在基因转录、翻译及翻译后修饰等不同阶段，实现对下游基因表达的抑制或激活。与传统的蛋白质调控方式相比，核糖开关对胞内代谢物以及胞外环境的变化更敏感、反应更快。

2、近年来应用核糖开关作为生物识别元件的研究越来越多，但与转录因子的开发相比，天然核糖开关的发现数量还非常有限，基于核糖开关的代谢物生物传感器研宄也尚处于起步阶段。但随着指数富集的配基系统进化技术selex的逐渐成熟，理论上研究人员可以获得与任何靶分子发生特异性结合的dna或rna序列。selex技术的基本思想是从体外的单链寡核苷酸库中，经过在特定缓冲体系与温度下与靶物质混合、分离获得靶分子－核酸适体复合物、将复合物中的靶分子与核酸适体分开、pcr阳性核酸，重复上述吸附-洗脱-扩增过程8-15次，最终获得与靶分子亲和力高的dna或rna。

3、麦角硫因(ergothioneine，egt)又叫2-硫基-l-组氨酸三甲基内盐，是一种稀有天然手性组氨酸衍生类硫醇化合物，最早由tamcet于1909年从麦角菌(clavicepspurpurea)中分离。麦角硫因作为机体内的一种重要活性分子，抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期或抗细胞衰老活性，改善神经细胞生成等多种生理功效；同时在多种疾病模型中包括阿兹海默、糖尿病等的并发症中，具有较好的保护细胞和抗击损伤的功效，因而也被认为是一种特有的、多功能的细胞生理保护剂，在食品、化妆品、医药等领域应用前景广阔。

4、然而，目前的重组菌株在生产效率和产量上仍无法符合工业化生产的要求。与传统基于转录因子的代谢调控手段相比，近年报道的核糖开关对配体的响应更为快速，而且结构简单，便于改造。核糖开关作为一种新型调控基因表达的方式，通过结合小分子配体使适体结构域的构象发生变化，继而可在转录、翻译、翻译后修饰等不同水平调节下游基因的表达。借助selex体外筛选技术，根据研宄者需要可筛分出能与任意配体识别的核糖开关适体结构域，搭配不同表达平台域即可实现多种研究需要，如代谢调控、高通量筛选、靶向抗菌药物开发等。目前己发现的天然核糖开关约有20多种，人工核糖开关的报道则不超过10种，小分子核糖开关几乎没有，且通过selex技术筛选出的核糖开关存在特异性差，相应应倍数不高等问题，通过selex技术筛选出特异性响应麦角硫因的核糖开关，从而实现新的麦角硫因的代谢调控方式，开发新的麦角硫因表达体系。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明要解决的技术问题是目前还没有能够成功筛选出特异性响应麦角硫因的核糖开关的方法。

3、[技术方案]

4、选择麦角硫因作为核糖开关研究的分子配体，利用体外selex筛选获得能与麦角硫因特异识别的适体库，进而以双选择标记基因作为报告基因，在生物体内富集获得能够响应麦角硫因的核糖开关库，具有成为新型麦角硫因代谢动态调控元件的潜质，或者可用于建立麦角硫因高通量筛选方法。

5、本发明的第一个目的是提供一种麦角硫因核糖开关的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

6、s1、构建随机dna文库，以50nt的随机序列为为模板建立dna文库；

7、s2、构建随机rna文库，以s1的随机dna文库为模板反转录得到随机rna文库；

8、s3、selex筛选，将s2中得到的随机rna文库，以egt为靶标物质进行6次以上的正向筛选，随后进行1～2次的负向筛选，得到适配体文库；

9、s4、构建核糖开关文库，在s3筛选得到的适配体文库的5’端连接启动子，在3’端连接筛选标记，随后连接至表达载体，并转化至宿主细胞，构建得到核糖开关文库；

10、s5、核糖开关的胞内富集，利用镍离子、四环素、egt和/或egt合成必需氨基酸对s4构建的核糖开关文库进行5轮的富集；

11、s6、核糖开关的验证，将s5富集的核糖开关分别接种于含有egt的培养基中，活化培养，采集荧光信号，并进行特异性检测。

12、在一种实施方式中，s3中，将随机rna文库和egt结合孵育后再加入至重力柱中进行正向筛选。

13、在一种实施方式中，s3中，将随机rna文库和0.2～1mg egt在35～38℃孵育0.5～1.5h后加入至重力柱中35～38℃震荡0.5～1.5h。

14、在一种实施方式中，所述随机rna文库经热变性后冷却复性。

15、在一种实施方式中，所述随机rna文库经95℃变形后冷却至室温，静置20min复性。

16、在一种实施方式中，s3中，每次正向筛选结束后，利用pcr扩增富集筛选到的阳性文库。

17、在一种实施方式中，s3中，在进行负向筛选前利用引物扩增引入10个核苷酸，所述引物为gaaatctgatggctagctcagtcctagggattatgctagcgacgacgatgacacgat和cggtttcatatgtatatctccttcnnnnnnnnnntggtcatgtgatcggcgtat。

18、在一种实施方式中，s3中，所述负向筛选为将正向筛选得到的rna文库复性后加入至重力柱中孵育一定时间。

19、在一种实施方式中，所述孵育的温度为35～38℃，时间为0.5～1.5h。

20、在一种实施方式中，所述重力柱中含有琼脂糖微球。

21、在一种实施方式中，所述启动子为j23101、j23110、j23113、j23116、j23119中的一种或几种。

22、适体域文库与rbs之间引入一段长度为10个核酸的随机序列。

23、在一种实施方式中，所述筛选标记为氨基酸序列如seq id no.4所示的teta-sgfp融合蛋白。

24、在一种实施方式中，所述表达载体为pet系列载体、pbad、pzs、pcas9或pcdf。

25、在一种实施方式中，所述pet系列载体包括pet21a或pet28a。

26、在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

27、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括bw25113、bl21、trans5α、transt1或w3110。

28、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为bw25113。

29、在一种实施方式中，s5中，将s4构建的核糖开关文库活化并接种至含有镍离子和egt合成必需氨基酸的培养基中进行负筛，获得一级菌液；将一级菌液接种至含有egt的培养基中活化，获得二级菌液；将二级菌液接种含有四环素和egt的培养基中培养获得三级菌液；将三级菌液接种于含有egt和egt合成必需氨基酸的培养基中活化获得四级菌液；将四级菌液接种于含有镍离子、egt和egt合成必需氨基酸的培养基中获得五级菌液。

30、在一种实施方式中，所述egt合成必需氨基酸的浓度为80～120mg/l，所述egt合成必需氨基酸选自甲硫氨酸，半胱氨酸或组氨酸中的一种或几种。

31、在一种实施方式中，所述培养基的ph为6.0～7.0。

32、在一种实施方式中，所述培养基包括m9培养基。

33、在一种实施方式中，所述egt的浓度为50～100mg/l，所述镍离子浓度为100～225μm2，所述四环素的浓度为20～50μg/ml。

34、在一种实施方式中，所述特异性检测为将s6中活化培养的菌液分别接种于含有麦角硫因或麦角硫因结构类似物的培养基中，筛选对麦角硫因有响应的同时对麦角硫因结构类似物没有响应的菌株。

35、本发明的第二个目的是提供egt核糖开关，所述egt核糖开关的序列如seq idno.1～seq id no.3任一所示。

36、本发明的第三个目的是提供一种生物传感器，所述生物传感器携带上述egt核糖开关。

37、本发明还提供了上述egt核糖开关或上述生物传感器在egt合成中的应用。

38、[有益效果]

39、1.本发明筛选麦角硫因核糖开关的方法是在selex筛选流程中，将变性后的rna和egt结合孵育再放入柱中与琼脂糖微球震荡结合解决了小分子和rna的空间位阻问题，提高洗脱率，增加现有核酸适配体的筛选技术的成功率；

40、2.本发明筛选麦角硫因核糖开关的方法在选择表达宿主时通过筛选镍离子耐受能力较强的菌株作为表达宿主，能够选出合适的镍离子浓度进行体内筛选，更加有效地筛选掉阴性菌，降低结果的假阳性。

41、3.本发明筛选麦角硫因核糖开关的方法在进行体内筛选过程中，通过优化m9培养基，解决了镍离子沉淀问题，以排除沉淀对筛选的干扰。

42、4.本发明筛选麦角硫因核糖开关的方法在进行体内筛选时，在负筛流程中加入egt结构类似物和egt合成必需氨基酸，去除了响应egt结构类似物的菌株，进一步提高筛选得到的核糖开关的特异性。

43、5.本发明筛选得到的麦角硫因核糖开关对麦角硫因结构类似物完全无响应，而在含有麦角硫因的培养基中具有较强的荧光增长倍数，具有很强的特异性。