一种M-MLV逆转录酶及表达基因、制备方法和应用与流程

本发明涉及dna检测，特别是涉及一种m-mlv逆转录酶及表达基因、制备方法和应用。

背景技术：

1、核酸检测技术，在经历了数十年的发展与近几年的快速成熟后，目前已广泛运用于传染病病原检测(包括细菌、支原体、病毒等)、肿瘤突变检测、遗传病检测、个体基因型检测等各个方面。在已经建立的核酸扩增技术中，聚合酶链式反应(pcr)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，现已被广泛应用于生物、医学等相关领域。为了克服pcr扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较pcr技术而言，不依赖于热循环扩增设备、反应速度快、敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增、便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(rca)、链置换扩增(sda)、解旋酶依赖的恒温扩增(hda)、环介导恒温扩增(lamp)、交叉扩增(cpa)等。而目前检测rna细菌或rna病毒的方法中，都需要采用逆转录酶，通过逆转录酶先将rna反转录为dna，然后再通过引物组和dna聚合酶进行等温扩增，达到检测靶rna的目的。逆转录酶是分子生物学研究和应用中广泛使用的一种工具酶。它以rna为模板合成dna的dna聚合酶，具有rnase h活性，不具有3’-5’外切酶活性，可用于逆转录合成cdna，是进行rna分析和检测的重要手段，在基因表达分析、基因功能研究、病原体检测、遗传病筛查等诸多领域均有广泛的使用。莫罗尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,m-mlv)逆转录酶是目前常用的逆转录酶之一，该酶是一条多肽链，包含n端聚合结构域与c端rnaseh结构域，但是该酶在应用中仍存在诸多的限制，其中一点就是m-mlv逆转录酶的抗抑制性较差。现有的核酸检测技术通常需要对样本进行核酸前处理，例如rna的提取和纯化等，以除去样本中抑制酶活性的物质或杂质，若直接将待检测样本与酶反应，样本中的杂质会降低或抑制m-mlv逆转录酶的活性导致反转录效率降低。显然，是否能够对rna样本，在现场进行快速的核酸检测，很大程度取决于用于rna核酸扩增-检测的核心蛋白——m-mlv逆转录酶的抗抑制性。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种m-mlv逆转录酶，该m-mlv逆转录酶通过在14个位点具有特定的氨基酸，从而具有良好的抗抑制性，不容易被待测样本中抑制酶活性的物质或杂质影响，同时还能发挥良好的rna逆转录作用，能有效应用于rna的逆转录操作和现场的快速核酸检测，从而有效解决现有技术中m-mlv逆转录酶容易被环境中抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致核酸检测效率低的技术问题。

2、本发明提供了一种m-mlv逆转录酶，该m-mlv逆转录酶在以下14个位点具有如下氨基酸：

3、第16位氨基酸为天冬氨酸，第143位氨基酸为赖氨酸或天冬氨酸，第204位氨基酸为精氨酸，第286位氨基酸为精氨酸或天冬氨酸，第289位氨基酸为亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸，第306位氨基酸为赖氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，第308位氨基酸为赖氨酸、天冬酰胺或酪氨酸，第309位氨基酸为天冬酰胺或缬氨酸，第391位氨基酸为丝氨酸、亮氨酸或色氨酸，第471位氨基酸为缬氨酸，第495位氨基酸为赖氨酸，第524位氨基酸为甘氨酸，第562位氨基酸为谷氨酰胺或天冬氨酸，第583位氨基酸为天冬酰胺或谷氨酸。

4、可以理解的，上述第n位氨基酸(n为氨基酸的位数，例如，第16位氨基酸)指的是野生型m-mlv逆转录酶中对应的第n位氨基酸。

5、上述m-mlv逆转录酶具有良好的抗抑制性，不容易被待测样本中抑制酶活性的物质或杂质影响，同时还能发挥良好的rna逆转录作用，能有效应用于rna的逆转录操作和现场的快速核酸检测，从而有效解决现有技术中m-mlv逆转录酶容易被环境中抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致核酸检测效率低的技术问题。

6、在其中一个实施例中，所述m-mlv逆转录酶除所述14个位点以外的剩余氨基酸序列与野生型m-mlv逆转录酶的氨基酸序列相同，所述野生型m-mlv逆转录酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

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16、在其中一个实施例中，所述m-mlv逆转录酶由所述野生型m-mlv逆转录酶突变改造得到。

17、在其中一个实施例中，所述突变改造包括随机突变或饱和突变。

18、在其中一个实施例中，所述突变改造包括：第16位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第143位氨基酸由组氨酸突变为赖氨酸或天冬氨酸，第204位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，第286位氨基酸由谷氨酸突变为精氨酸或天冬氨酸，第289位氨基酸由蛋氨酸突变为亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸，第306位氨基酸由苏氨酸突变为赖氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，第308位氨基酸由甘氨酸突变为赖氨酸、天冬酰胺或酪氨酸，第309位氨基酸由苯丙氨酸突变为天冬酰胺或缬氨酸，第391位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸、亮氨酸或色氨酸，第471位氨基酸由谷氨酰胺突变为缬氨酸，第495位氨基酸由半胱氨酸突变为赖氨酸，第524位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，第562位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺或天冬氨酸，第583位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酸。

19、在其中一个实施例中，所述m-mlv逆转录酶的氨基酸序列如seq id no:2、seq idno:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8，或seq id no:9所示。

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38、如seq id no:3所示的m-mlv逆转录酶的氨基酸序列，通过野生型m-mlv逆转录酶进行以下14个位点的突变改造得到：

39、第16位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第143位氨基酸由组氨酸突变为天冬氨酸，第204位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，第286位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第289位氨基酸由蛋氨酸突变为脯氨酸，第306位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸，第308位氨基酸由甘氨酸突变为天冬酰胺，第309位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸，第391位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第471位氨基酸由谷氨酰胺突变为缬氨酸，第495位氨基酸由半胱氨酸突变为赖氨酸，第524位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，第562位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第583位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸。

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68、(seq id no:6)；如seq id no:6所示的m-mlv逆转录酶的氨基酸序列，通过野生型m-mlv逆转录酶进行以下14个位点的突变改造得到：

69、第16位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第143位氨基酸由组氨酸突变为天冬氨酸，第204位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，第286位氨基酸由谷氨酸突变为精氨酸，第289位氨基酸由蛋氨酸突变为脯氨酸，第306位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸，第308位氨基酸由甘氨酸突变为天冬酰胺，第309位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸，第391位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第471位氨基酸由谷氨酰胺突变为缬氨酸，第495位氨基酸由半胱氨酸突变为赖氨酸，第524位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，第562位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第583位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸。

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80、(seq id no:7)；如seq id no:7所示的m-mlv逆转录酶的氨基酸序列，通过野生型m-mlv逆转录酶进行以下14个位点的突变改造得到：

81、第16位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第143位氨基酸由组氨酸突变为天冬氨酸，第204位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，第286位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第289位氨基酸由蛋氨酸突变为苯丙氨酸，第306位氨基酸由苏氨酸突变为半胱氨酸，第308位氨基酸由甘氨酸突变为酪氨酸，第309位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸，第391位氨基酸由脯氨酸突变为色氨酸，第471位氨基酸由谷氨酰胺突变为缬氨酸，第495位氨基酸由半胱氨酸突变为赖氨酸，第524位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，第562位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第583位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸。

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92、(seq id no:8)；如seq id no:8所示的m-mlv逆转录酶的氨基酸序列，通过野生型m-mlv逆转录酶进行以下14个位点的突变改造得到：

93、第16位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第143位氨基酸由组氨酸突变为赖氨酸，第204位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，第286位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第289位氨基酸由蛋氨酸突变为脯氨酸，第306位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸，第308位氨基酸由甘氨酸突变为天冬酰胺，第309位氨基酸由苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第391位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，第471位氨基酸由谷氨酰胺突变为缬氨酸，第495位氨基酸由半胱氨酸突变为赖氨酸，第524位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，第562位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺，第583位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。

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103、本发明还提供了一种编码所述m-mlv逆转录酶的表达基因。

104、在其中一个实施例中，所述表达基因的核苷酸序列如seq id no:10所示。

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124、本发明还提供了一种表达载体，包括所述表达基因。

125、在其中一个实施例中，所述表达载体的初始载体为pet-30a(+)或pet-28a质粒载体。

126、本发明还提供了一种重组细胞，包括所述表达载体。

127、在其中一个实施例中，所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌bl21菌株。

128、本发明还提供了一种所述m-mlv逆转录酶的制备方法，包括以下步骤：将所述表达基因插入初始载体中，构建得到表达载体，将表达载体转入感受态的宿主细胞中，通过筛选得到阳性重组细胞，诱导表达，即得。

129、本发明还提供了所述m-mlv逆转录酶在rna逆转录、rt-pcr或等温扩增中的应用。

130、本发明还提供了一种用于核酸检测的试剂盒，包括：bst dna聚合酶和所述m-mlv逆转录酶；

131、所述bst dna聚合酶为野生型bst dna聚合酶，所述野生型bst dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no:11所示；

132、或所述bst dna聚合酶在以下10个位点具有如下氨基酸：第1位氨基酸为谷氨酸，第3位氨基酸为谷氨酸，第284位为苯丙氨酸，第305位为赖氨酸，第333位为赖氨酸，第334位为谷氨酸，第335位为精氨酸，第390位为苏氨酸，第480位为赖氨酸，第518位为精氨酸。

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141、本发明的m-mlv逆转录酶与bst dna聚合酶配合，可以搭配lamp、near、rpa等多种恒温扩增方法使用，该m-mlv逆转录酶具有良好的抗抑制性能，对于现场采集的待测样本，可直接进行反转录，进行等温扩增检测，无需进行如核酸提取、纯化等样本的前处理操作，从而使简单的样本处理法和等温扩增技术紧密联合，真正缩短检测周期，充分发挥等温扩增技术快速、灵敏、便捷的特点。上述试剂盒可用于检测rna，如rna新冠病毒等rna病原体。

142、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括：核糖核酸酶、探针、引物组、dna聚合酶底物、扩增缓冲液；所述bst dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no:12所示。

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151、采用上述m-mlv逆转录酶与bst dna聚合酶配合使用，待测样本的扩增成功率更高。上述dna聚合酶底物又称dntps。

152、在其中一个实施例中，所述单链探针包括dna碱基、rna碱基和碱基替代物，所述rna碱基将所述单链探针分隔为至少2个区段，所述碱基替代物为标记在碱基和/或核酸骨架上的标记物。

153、在其中一个实施例中，所述标记物包括荧光基团或淬灭基团。

154、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

155、本发明的突变改造m-mlv逆转录酶及表达基因、制备方法和应用，该突变改造m-mlv逆转录酶在14个位点具有特定的氨基酸，使该m-mlv逆转录酶具有良好的抗抑制性，不容易被待测样本中抑制酶活性的物质或杂质影响，同时还能发挥良好的rna逆转录作用，能有效应用于rna的逆转录操作和现场的快速核酸检测，从而有效解决现有技术中m-mlv逆转录酶容易被环境中抑制酶活性的物质或杂质干扰，导致核酸检测效率低的技术问题。不仅如此，该m-mlv逆转录酶可以搭配lamp、near、rpa等多种恒温扩增方法使用，与dna聚合酶配合使用，对于现场采集的待测样本，可直接进行反转录，进行等温扩增检测，无需进行如核酸提取等样本的前处理操作，从而使简单的样本处理法和等温扩增技术紧密联合，真正缩短检测周期，充分发挥等温扩增技术快速、灵敏、便捷的特点。