一种表面粘附发酵与膜分离相耦合连续生产乙醇的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种表面粘附发酵与膜分离相耦合连续生产乙醇的方法。

背景技术：

1、在乙醇连续化生产中，原位分离乙醇可减少乙醇对微生物细胞的抑制作用，从而提高乙醇的生产效率。渗透汽化膜分离技术作为一种常用的分离技术，通常被用于乙醇的分离过程中。例如中国发明cn 114807243 a中提到了利用气体装置通过膜分离法分离乙醇。然而，在长期的连续化分离乙醇过程中，由于发酵液中菌体细胞密度大，发酵液浊度高，因此微生物细胞以及裂解后的细胞碎片长期堆积在分离膜表面，对分离膜面污染严重，造成膜分离通量下降，乙醇的分离效率降低。中国发明cn 114807243 a虽然没有明确考察膜分离通量以及膜分离效率，但是该研究中明确表明维持发酵体系中高生物量进行发酵，依旧存在分离膜被污染的潜在风险。本发明提供了一种表面粘附发酵与膜分离相耦合连续生产乙醇的方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种表面粘附发酵与膜分离相耦合连续生产乙醇的方法。

2、发明思路：表面粘附发酵体系中发酵液中菌体细胞浓度低，发酵液浊度低，在表面粘附发酵与膜分离相耦合过程中，低浊度发酵液对分离膜的污染降低，利于产物分离、提高分离效率；此外，表面粘附发酵与膜分离耦合中，还具有降低甘油、琥珀酸等副产物的效果。

3、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种表面粘附发酵与膜分离相耦合连续生产乙醇的方法，将酿酒酵母接种于含有固体载体的发酵体系中进行表面粘附发酵产乙醇，所得发酵液转入膜分离组件中进行膜分离得到乙醇，分离后的发酵液再次进入发酵液体系中进行表面粘附发酵；其中，在膜分离开始后，膜分离与粘附发酵时同时进行的，形成循环；其中，通过膜分离可以移除发酵体系中的乙醇，解除乙醇对菌体细胞的抑制作用，同时还能分离收集乙醇，简化发酵工艺，实现连续化工艺流程。

4、其中，所述酿酒酵母为表达凝集素蛋白的重组酿酒酵母，通过基因工程技术增强了酵母细胞的粘附能力；优选地，所述凝集素蛋白为flo1、flo5、flo9、flo10、flo11、als1、als3和als5中的任意一种或几种组合，优选为flo5和/或flo10。

5、其中，所述flo1、flo5、flo9、flo10、flo11、als1、als3和als5的氨基酸序列的登记编号分别为np_009424.1、np_012081.1、np_009338.1、np_013028.1、np_012284.3、xp_718077.1、xp_710435.2、xp_718074.2；所述flo1、flo5、flo9、flo10、flo11的核苷酸序列的登记编号分别为nm_001178230.1、nm_001179342.1、nm_001178205.1、nm_001179892.1、nm_001179541.3；所述als1、als3、als5的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seqid no.3所示。

6、其中，所述表达为整合表达。

7、所述整合表达的基因组整合位点包括酿酒酵母1-16号染色体中的任一染色体，优选地，所述染色体为1号、4号、16号染色体，更优选地，所述整合表达的插入位点为106a、416d、1622b。

8、所述整合表达的方式包括同源重组、crispr基因编辑技术等等，优选为crispr/cas9基因编辑技术；所述表达所用启动子为组成型启动子，优选为tpi、tef1和tdh3中的任意一种；所述表达所用终止子为cyc1或adh1。

9、其中，所述重组酿酒酵母菌株的构建包括以下步骤：

10、(1)将crispr/cas9基因编辑质粒中20-nt序列更换为基因整合位点的序列，得到重构的crispr/cas9基因编辑质粒，如pcas-1622b；

11、(2)提取酿酒酵母的基因组；

12、(3)以酿酒酵母基因组作为模板，通过pcr的方式分别获得上游同源臂序列序列、下游同源臂序列、启动子序列、目标基序列、终止子序列；

13、(4)将(3)中所述基因片段按照上游同源臂-启动子-目标基因-终止子-下游同源臂的顺序进行连接获得同源重组片段；

14、(5)将(1)和(4)所述的重构crispr/cas9基因编辑质粒与同源重组片段转入酿酒酵母中，得到重组酿酒酵母菌株。

15、步骤(1)中，16号染色体中基因整合位点的20-nt序列(1622b)如seq id no.4所示。

16、步骤(2)中，所述酿酒酵母为saccharomyces cerevisiae cicc1308。步骤(3)中，所用启动子为组成型启动子；优选地，所述整合表达中所用启动子为tpi或tef1和tdh3中的任意一种；优选地，所述整合表达中所用终止子为cyc1或adh1。

17、步骤(3)中，目标基因flo1、flo5、flo9、flo10、flo11以saccharomycescerevisiae cicc1308基因组作为模板，通过pcr的方式分别获得；目标基因als1、als3、als5基因由生物科技公司合成。

18、步骤(5)中，所述重组酿酒酵母菌株在含有100-600mg/l g418抗生素的ypd培养基中进行筛选，优选地，所述重组酿酒酵母菌株在含有500mg/l g418抗生素的ypd培养基中进行筛选。

19、其中，所述固体载体包括棉纤维、玻璃片、聚酯纤维、尼龙纤维、木浆棉、聚乳酸、活性炭、聚乙烯、聚乙烯醇、聚氨酯、粘土、金属和陶瓷中的任意一种，优选为棉纤维。

20、其中，所述固体载体的含量为1-100g/l培养基，优选为30-50g/l培养基，进一步优选为35g/l培养基；优选地，所述培养基为种子培养基。

21、其中，所述酿酒酵母的种子液以1％-50％的体积比接种于培养基中产乙醇，优选为5％-15％，进一步优选为10％；优选地，所述培养基为种子培养基，优选为含有固体载体的种子培养基。

22、其中，所述发酵过程中所用种子培养基包括酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁；优选地，所述种子培养基中各组分的浓度为酵母粉6-14g/l、蛋白胨16-24g/l、葡萄糖18-26g/l、磷酸二氢钾0.5-2.5g/l、硫酸铵1-3g/l、硫酸镁0.3-0.7g/l，优选为酵母粉8-12g/l、蛋白胨18-22g/l、葡萄糖20-24g/l、磷酸二氢钾1-2g/l、硫酸铵1.5-2.5g/l、硫酸镁0.4-0.6g/l，进一步优选为酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖22g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、硫酸铵2g/l、硫酸镁0.5g/l。

23、其中，所述发酵体系中，发酵培养基中葡萄糖的初始浓度为50-250g/l，优选为150-150g/l，进一步优选为100g/l；优选地，所述发酵培养基还包括胰蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、七水合硫酸锌、七水合硫酸亚铁；优选地，所述发酵培养基中除葡萄糖外各组分的浓度为胰蛋白胨2-6g/l、酵母粉1-5g/l、磷酸二氢钾1-5g/l、硫酸铵2-6g/l、硫酸镁0.3-0.7g/l、七水合硫酸锌0.03-0.07g/l、七水合硫酸亚铁0.03-0.07g/l，优选为胰蛋白胨3-5g/l、酵母粉2-4g/l、磷酸二氢钾2-4g/l、硫酸铵3-5g/l、硫酸镁0.4-0.6g/l、七水合硫酸锌0.04-0.06g/l、七水合硫酸亚铁0.04-0.06g/l，进一步优选为胰蛋白胨4g/l、酵母粉3g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸铵4g/l、硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸锌0.05g/l、七水合硫酸亚铁0.05g/l。

24、其中，所述发酵体系中，发酵液的浊度od600nm值为30以下，优选为25以下，或15以下，或10以下，或5以下，或1以下，优选为15以下。

25、其中，所述表面黏附发酵是指酵母细胞可黏附至固体载体上形成生物被膜，生物被膜可以提高酵母细胞对环境的耐受性、维持细胞的生长能力和长时期的生物活性，其与交联法、包埋法等不同，表面黏附发酵在保证酵母细胞活性的同时还不会影响发酵体系中的动量传递、热量传递、质量传递，可以降低发酵液中菌体细胞密度、降低发酵液浊度。

26、在一些实施例中，所述表面粘附发酵为在发酵的起始阶段向种子培养基或发酵培养基中加入固体载体进行发酵，待发酵结束后，放出发酵液并保留固体载体，补入新鲜的发酵培养基继续发酵；优选地，所述发酵的起始阶段为一级种子液接入二级种子液之前；优选地，所述在发酵的起始阶段向种子培养基或发酵培养基中加入固体载体进行发酵为将一级种子液接入含有固体载体的二级种子液中进行发酵。

27、固体载体在一些实施例中，所述表面黏附发酵为将一级种子液接入含有固体载体的二级种子液中先静止培养，再流动循环培养，待发酵结束后，放出发酵液并保留固体载体，补入新鲜的发酵培养基，继续发酵。

28、其中，所述静止培养和流动循环培养的温度为25-35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃；优选地，所述静止培养的时间为1-7h，优选为3-5h，进一步优选为4h；优选地，所述流动循环培养的速率为10-50ml/min，优选为20-40ml/min，进一步优选为30ml/min；优选地，所述流动循环培养的时间为4-16h，优选为8-12h；优选地，所述补充新鲜的发酵培养基后发酵液循环流动，开始下一批发酵；优选地，所述发酵液的循环速率为10-50ml/min，优选为20-40ml/min，进一步优选为30ml/min。

29、其中，所述放出发酵液为放出总发酵液95％v/v以上的发酵液，优选为放出全部的发酵液；优选地，所述补入新鲜的发酵培养基的体积与所述放出发酵液的体积相同。

30、其中，所述发酵的温度为25-37℃，优选为28-37℃，进一步优选为35℃。

31、其中，当发酵液中乙醇含量为5g/l以上时，将发酵液转入膜分离组件；优选地，当发酵液中乙醇含量为5g/l，或10g/l，或15g/l，或20g/l，或25g/l，或30g/l，或35g/l，或40g/l，或45g/l，或50g/l，或55g/l，或60g/l，或65g/l，或70g/l，或75g/l，或80g/l，或85g/l，或90g/l，或95g/l，或100g/l时将发酵液转入膜分离组件；进一步优选地，当发酵液中乙醇含量为10g/l，或15g/l，或20g/l，或25g/l，或30g/l，或35g/l，或40g/l时将发酵液转入膜分离组件；更进一步优选地，当发酵液中乙醇含量为20g/l时将发酵液转入膜分离组件。

32、其中，所述发酵液以5-1000ml/min的流速转入膜分离组件，优选为300-500ml/min，进一步优选为450ml/min。

33、其中，将发酵液转入膜分离组件后，所述发酵体系中葡萄糖的浓度维持为5-100g/l，优选为10-90g/l，进一步优选为20-80g/l。

34、其中，所述膜分离组件中的分离膜为渗透汽化膜；优选地，所述膜分离组件中分离膜的材质为聚二甲基硅氧烷；优选地，所述膜分离组建中分离膜的面积为75-500cm2，优选为300-400cm2，进一步优选为314cm2。

35、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

36、本发明所提供的表面粘附发酵与膜分离相耦合连续生产乙醇的方法，能降低发酵液浊度、减少分离膜被污染、提高膜分离效率、降低发酵代谢副产物甘油、琥珀酸。本发明所提供的重组菌株的粘附能力更好，所得发酵液的粘度更低，利于膜反应分离。