一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺的制作方法

本发明属于微生物发酵，尤其涉及一种高效分泌表达重组人源ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺。

背景技术：

1、人源胶原蛋白由于具备抗原性弱，利于细胞黏附，可诱导细胞增殖、分化，可为细胞长入胶原沉积和新血管形成提供支架，其降解产物也可为创面修复提供必须的氨基酸等优势，因而成为制备创面敷料、化妆品、组织工程、医疗器械等应用领域的重要材料。人体皮肤内胶原蛋白为i型胶原和iii型胶原。成人皮肤组织中i型胶原蛋白比例较高，胎儿皮肤组织中ⅲ型胶原蛋白比例明显较成人高。婴幼儿皮肤受损恢复后无瘢痕，其中ⅲ型胶原蛋白起了主要作用，因而提高ⅲ型胶原蛋白比例有望增加皮肤弹性，减轻瘢痕增生，所以ⅲ型胶原蛋白在化妆品中更有应用价值。

2、人源ⅲ型胶原蛋白由三条相同的α1链缠绕组成。随着生物工程技术的不断进步，利用基因工程生产人源胶原蛋白的技术近几年逐渐成熟，其中又分为第二代利用大肠杆菌表达重组人胶原蛋白的技术和利用毕赤酵母表达重组人胶原蛋白的第三代技术。从重组表达产量来看，人源ⅲ型胶原蛋白α1单链很适合毕赤酵母分泌表达，产量较高，但存在发酵过程中降解较严重的问题。

3、国内外研究机构及企业对人或动物胶原蛋白单链的重组表达或者人工改造的研究及生产已有较多报道(yang s et al.2021.fermentationprocess withpichiayeastexpressingrecombinant protein.us专利号011136373b2)；dai l.et al.2019.yeaststrains and methods for producing collagen.us专利号20190002893a1；van heerdegv et al.2012.method for recombinant microorganism expression and isolationofcollagen-like polypeptides.us专利号008188230b2；he j et al.2015.new strategyfor expression ofrecombinant hydroxylated human collagenα1(iii)chainsinpichiapastoris gs115.biotechnolappl biochem.62(3):293-9.doi:10.1002/bab.1264)。芬兰奥卢大学胶原蛋白研究中心对胶原蛋白的分泌表达和胞内表达进行了比较研究；美国的davidr.olsen等的研究表明i型胶原的基因中不含两端前肽基因时，表达量分别为原胶原的18倍、缺乏n前肽基因的4.6倍和缺乏c前肽基因的3倍，这些研究报道为利用毕赤酵母生产重组胶原蛋白提供了技术基础。胶原蛋白单链的生产技术目前是以毕赤酵母表达体系为最佳。完全按照天然氨基酸序列的毕赤酵母表达人源ⅲ型胶原蛋白α1单链的研究，其产量在4.5g/l以上，但由于分子量在90kd以上，对毕赤酵母表达造成一定影响，且由于存在多个蛋白酶降解位点，因而发酵过程中需要解决蛋白降解问题，代表性研究机构为西北大学范代娣课题组、江苏悦智生物医药有限公司(中国专利201911093124.8)。为此，不少研究机构的重组胶原蛋白产品是改变了氨基酸组成的类人胶原蛋白或明胶类似物，蛋白降解程度减小了，但由于氨基酸序列的改变，其应用存在局限性，该类产品的代表性研究机构为南京理工大学和江苏江山聚源生物技术有限公司(中国专利201110327865.5、201810049618.5)。另外，基因辅表达策略，比如导入hac1、pdi等辅表达基因(han m.etal.2021.increased expression of recombinant chitosanase by co-expression ofhac1p in the yeast pichia pastoris.protein pept lett.28(12):1434-1441.doi:10.2174/0929866528666211105111155；bao c.et al.2020.expression and function ofan hac1-regulated multi-copy xylanase gene in saccharomyces cerevisiae.scirep 10(1):11686.doi:10.1038/s41598-020-68570-6.)在毕赤酵母表达重组蛋白中已有一些实例的应用，但在有关胶原蛋白的重组表达中，尚未见应用报道。

4、在毕赤酵母高密度发酵工艺的研究中，对于减少胶原蛋白的降解已有一些文献报道。和invitrogen公司“pichia fermentation process guidelines”推荐的工艺类似，中国专利202111190388.2提到在诱导期间一次性添加酪蛋白氨基酸15g/l可竞争性地减少重组胶原蛋白的降解；中国专利201810049618.5中提到，在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5m l-赖氨酸或l-精氨酸能有效防止目的产物被蛋白酶降解，且该工艺较添加酪蛋白氨基酸成本低。但中国专利201810049618.5是针对非天然序列的重组胶原蛋白，对于诱导初期就有降解现象发生的基于天然序列的重组胶原蛋白并不适用。因此，添加酪蛋白氨基酸的工艺有效，但工艺仍需提升、成本上仍需要降低。

5、上述背景表明，基于天然序列的人源ⅲ型胶原蛋白α1链的重组表达在菌株构建及减少蛋白降解的发酵工艺上均迫切需要开发新的技术。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种高效分泌表达重组人源ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺，所述重组毕赤酵母能够高效分泌表达人源ⅲ型胶原蛋白α1链，相配套的高密度发酵工艺可以使得胶原蛋白降解率控制在10％以下，可降低纯化成本，满足化妆品原料等产品的应用要求。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种重组毕赤酵母菌种，所述重组毕赤酵母菌种是将seq id no.1所示基因col-c、seq id no.3所示基因hac1分别导入宿主菌，并以ptva技术筛选优化的拷贝数组合获得的。

4、本发明所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)gs115(购自invitrogen)。

5、进一步地，胶原蛋白基因col-c优选自人源ⅲ型胶原蛋白αⅰ链(ncbi序列号：nm_000090.4，来源于homo sapiens)c端的部分连续基因，其序列位于去端肽人源ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的1824-3204位核苷酸。优选的序列经毕赤酵母偏好密码子优化后由南京金斯瑞公司合成，对应基因序列为seq id no.1，其氨基酸序列如seq id no:2所示。本发明对选取自nm_000090.4的不同长度、不同位置的连续基因片段，分别进行了克隆表达，所述seq id no.1为分泌表达量最高的优选基因片段。

6、本发明所述基因hac1编码的hac1p蛋白是酵母内质网中未折叠蛋白响应机制(upr)的激活因子。以酿酒酵母by4741(购自invitrogen)为模板，扩增hac1基因片段，得到如seq id no.3所示的upr激活因子基因hac1，利用一步克隆试剂盒将该基因与组成型表达载体pgapz b(购自invitrogen)进行无缝连接，构建表达载体pgapz-hac1。

7、本发明所述重组毕赤酵母菌种按如下方法构建：

8、将表达载体ppic9k-col-c电转入宿主菌gs115中，筛选得到单拷贝col-c基因的工程菌，利用转化后载体扩增方法(试管液体ptva法)获得具有1-6个col-c基因拷贝数的工程菌，发酵比较后确定分泌表达最优的col-c基因3拷贝菌株gs-col3。将表达载体pgapz-hac1电转入上述工程菌gs-col3中，筛选得到col-c基因3拷贝、hac1基因单拷贝的工程菌，进一步利用转化后载体扩增方法(试管液体ptva法)获得具有1-6个hac1基因拷贝数的工程菌，发酵比较后确定分泌表达最优的col-c基因3拷贝、hac1基因3拷贝的工程菌株gs-col3-h3。

9、本发明所述重组毕赤酵母菌种的构建具体为：

10、(1)选用毕赤酵母gs115作为出发菌株；

11、(2)构建表达载体

12、将选取的人源ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列按照毕赤酵母偏好密码子优化后人工合成，得到基因col-c(seq id no.1)，将基因col-c连接在毕赤酵母表达载体ppic9k中，构建得到表达载体ppic9k-col-c；

13、以酿酒酵母by4741(购自invitrogen)为模板扩增hac1基因片段，得到如seq idno.3所示的upr激活因子基因hac1，该基因与pgapz b载体利用一步克隆试剂盒进行无缝连接，构建表达载体pgapz-hac1；

14、(3)将表达载体ppic9k-col-c电转化至毕赤酵母菌株gs115中，同源重组整合至其基因组，构建出重组毕赤酵母菌株gs-col；

15、(4)对重组毕赤酵母菌株gs-col进行转化后载体扩增(基于g418浓度递增的试管液体ptva法)，以荧光定量pcr方法检测筛得菌株的基因拷贝数，得到col-c基因拷贝数为1～6的不同毕赤酵母菌株；经过摇瓶发酵筛选，获得一株胶原蛋白表达量最高、col-c基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株gs-col3；

16、(5)将表达载体pgapz-hac1电转入重组毕赤酵母菌株gs-col3中，筛选得到整合有hac1基因的重组毕赤酵母gs-col3-h；

17、(6)对重组菌株gs-col3-h进行转化后载体扩增(基于zeocin浓度递增的试管液体ptva法试管液体)，以荧光定量pcr方法检测筛得菌株的hac1基因拷贝数，得到hac1基因拷贝数为1～6的不同毕赤酵母菌株；经过摇瓶发酵筛选，获得一株胶原蛋白表达量最高、col-c基因拷贝数为3、hac1基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株gs-col3-h3。

18、本发明还提供了一种可减少重组人源ⅲ型胶原蛋白α1链降解的高密度发酵工艺，该工艺的关键步骤为：甘油补料阶段添加终浓度0.1m的硫酸铵，甲醇诱导阶段ph控制在3.0，同时在诱导阶段添加酪蛋白水解物，通过指数流加方式流加甲醇以控制比生长速率在0.03h-1。

19、具体地，本发明所述重组毕赤酵母工程菌gs-col3-h3的高密度发酵按如下优化后的工艺组合进行：将重组毕赤酵母接种至含bsm培养基的发酵罐中，用氨水控制ph在5.0，温度为30℃，初始转速设置为400r/min并逐步提升，调节通气量，控制溶氧在20％以上；当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，随即开始以10-50ml/h/l发酵液的速度流加含ptm112ml/l的体积浓度50％的甘油水溶液，同时关停与ph关联的氨水自动补料泵，让发酵液ph自然下降到3.0再打开氨水泵，并一次性添加终浓度为0.1m的硫酸铵。甘油补料培养至菌体湿重为150-180g/l；甘油流加结束后，一次性补加甲醇至终浓度3g/l，同时在诱导开始及诱导32h时分别添加终浓度为5g/l的酪蛋白水解液。甲醇补料以3.6ml/h/l流速起始并按指数流加模式递增，使工程菌比生长速率维持在0.03h-1。发酵培养至菌体湿重达到400g/l时结束。

20、所述bsm培养基：h3po431.4 ml/l，koh 4.13g/l，k2so418.2 g/l，caso40.93 g/l，mgso47 h2o 14.9g/l，甘油40.0g/l，接种前用氨水调ph到5.0-5.5，并加4.35ml/l的ptm1；

21、ptm1配方：h3bo30.02 g/l，cuso4.5 h2o 6.0g/l，mnso4.h2o 3.0g/l，na2moo4.2h2o0.2g/l，cocl20.5 g/l，nai 0.08g/l，zncl220.0 g/l，feso4.7 h2o 65.0g/l，生物素0.2g/l，5.0ml/l的h2so4，ddh2o定容至1l。

22、本发明所述的高密度发酵工艺，其特征在于所述重组毕赤酵母在发酵前，先进行两级种子扩大培养，二级种子od为5-6时，以体积浓度10％接种量接种至bsm培养基。所述两级扩大培养是将重组毕赤酵母接种至bmgy液体培养基，30℃培养10-24h。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、本发明seq id no.1所示胶原蛋白基因col-c是通过选取不同长度、不同位置基因序列分别克隆表达后优选得到的源自人源ⅲ型胶原蛋白αⅰ链(ncbi序列号：nm_000090.4，来源于homo sapiens)c端的部分连续基因，其序列位于去端肽人源ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的1824-3204位核苷酸，优选的该序列没有改变天然人源氨基酸序列，同时对应的肽链长度只有约全长人源胶原蛋白肽链的一半，因而更适合毕赤酵母表达。进一步地，本发明将hac1基因导入了表达col-c的重组毕赤酵母中，并且在不同拷贝数的组合中筛选出了col-c基因拷贝数为3、hac1基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株gs-col3-h3，这一优化的基因拷贝数组合大大提高了胶原蛋白的分泌表达效率。

25、本发明优化得到的高密度发酵工艺提供了一种配套的可减少重组人源ⅲ型胶原蛋白α1链降解的策略。和使用invitrogen公司“pichia fermentation processguidelines”里推荐的常规工艺相比较，菌株gs-col3-h3在5l发酵罐中应用该工艺后重组胶原蛋白的降解率由50％减少至10％以下。另外，由于在高密度发酵阶段组合应用了降ph、控制比生长速率、添加硫酸氨等工艺，酪蛋白氨基酸添加量减少，生产成本更低。