小麦分子标记Qphr-3A及其在氮高效育种中的应用的制作方法

本发明属于生物，涉及小麦分子标记qphr-3a及其在氮高效育种中的应用。

背景技术：

1、在过去五十多年间，全球作物生产上施用的氮肥量增加了20余倍，预计到2050年还将增加3倍。高肥低效问题在作物生产上表现突出，自上世纪90年代起，化肥施用量增加对粮食产量增产的效应已不显著，肥料利用率也逐年降低。基因型、环境和栽培管理措施共同影响作物的氮素利用率(nue，nitrogen use efficiency)，因此提高nue的主要措施有合理水肥管理、高效新型肥料推广、土壤地力提升、小麦品种遗传改良等，而通过遗传改良提高小麦nue是最为有效和可持续的解决办法。

2、nue是由氮素吸收、同化和转运等复杂多基因网络调控和受环境影响共同控制的过程。在小麦氮素吸收的相关基因研究中，研究人员发现了一个影响小麦nue的基因tanrt2.1-6b，该基因为双亲和性硝酸盐转运蛋白基因，主要作用于氮素吸收过程(li m,wang t,zhang h,liu s,li w,abou elwafa sf and tian h(2022)tanrt2.1-6b isadual-affinity nitrate transporter contributing to nitrogen uptake in breadwheat under both nitrogen deficiency and sufficiency.the crop journal 10:993-1005.)。另外，研究人员还发现tanac2-5a是一个受到硝酸根诱导表达的转录因子，它不仅正调控小麦的根系生长，还正调控多个tanrt2基因表达，增强了小麦根系吸收硝态氮的速率，并参与调控硝态氮在小麦中的长距离运输，因而可增加籽粒硝酸根含量和种子活力(liw,he x,chen y,jing y,shen c,yang j,teng w,zhao x,hu w,hu m,li h,miller aj andtong y(2020)a wheat transcription factor positively sets seed vigour byregulating the grain nitrate signal.new phytol 225:1667-1680.)；在小麦氮素同化的相关基因研究中，研究人员将优良等位变异tags2-2ab转化小麦，发现在不同氮水平均显著高于野生型的产量、氮素吸收能力和氮素收获指数(hu m,zhao x,liu q,hong x,zhangw,zhang y,sun l,li h and tong y(2018)transgenic expression of plastidicglutamine synthetase increases nitrogen uptake and yield in wheat.plantbiotechnol j 16:1858-1867.)。

3、因此，发掘控制nue的相关基因，并开发对应分子标记，以用于小麦氮高效分子育种，对于高产、绿色、高效型小麦新品种选育具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明通过对收集的244份小麦种质资源调查nue相关性状表型，结合660k snp芯片基因分型信息，实施全基因组关联分析(gwas)，检测到一个稳定表达且表型效应值大于10％的显著性snp位点3363。基于该位点的snp多态性开发了对应的kasp特异性引物组合，结合nue相关表型确定了优异单倍型。所述的kasp特异性引物组合可为小麦氮高效分子育种提供技术支持。

2、本发明可通过如下技术方案实现：

3、本发明以snp等位变异的单倍型结合nue相关性状相关性分析，发现存在氮高效优势单倍型。在参考基因组chinese spring v1.0中，染色体3al的67365306处存在snp，具体为a/g。为了将该snp等位变异应用于所有小麦种质资源，本发明中表示为，该snp位于seqid no:1所示序列的第51个碱基处，命名该snp位点为分子标记qphr-3a。

4、seq id no:1为

5、agaaccatctcaaccaaacgtttttgttgtctaatatgaagcgatcaactnttttgaactcgttgtcttcaactaccagcgcatatccaatatcttttgca，其中n为a/g。

6、采用上述qphr-3a分子标记检测小麦材料携带snp基因型为gg时，其表现为氮高效类型，其籽粒产量(gy，g·m-2)、籽粒氮素积累量(naa，g·m-2)和氮素收获指数(nhi，％)显著高于该snp位点携带为aa的小麦材料。

7、本发明提供了用于检测分子标记qphr-3a的成套kasp特异性引物或试剂盒。

8、所述成套引物组包含两条上游引物和一条下游引物，上游引物根据所示seq idno:1碱基序列第51位snp及其上游序列进行设计，其中一条上游引物的3’末端为a，另一条上游引物的3’末端为g；下游引物根据所示seq id no:1碱基序列第51位snp及其下游序列进行设计。

9、所述kasp特异性引物序列如下：

10、引物qphr-3a-f1，如seq id no:2所示；

11、引物qphr-3a-f2，如seq id no:3所示；

12、引物qphr-3a-r，如seq id no:4所示。

13、qphr-3a-f1：5'-gaaggtcggagtcaacggatttaatatgaagcgatcaacta-3'；

14、qphr-3a-f2：5'-gaaggtgaccaagttcatgcttaatatgaagcgatcaactg-3'；

15、qphr-3a-r：5'-tacgatgttttatgtatgacg-3'。

16、在实施例中，特异荧光标签序列a为hex(红色)如seq id no:5所示，特异荧光标签序列g为fam(蓝色)如seq id no:6所示：

17、特异荧光标签序列hex：5'-gaaggtcggagtcaacggatt-3'；

18、特异荧光标签序列fam：5'-gaaggtgaccaagttcatgct-3'。

19、本发明提供了上述qphr-3a分子标记及其kasp引物在以下方面的应用：

20、(a)选育或筛选氮素利用率较高的小麦株系、品系或品种；

21、(b)鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦材料的氮素利用率；

22、(c)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦材料氮素利用率的产品；

23、(d)制备用于选育或筛选氮素利用率较高的小麦株系、品系或品种的产品；

24、在某些实施例中，具体操作步骤为，利用上述kasp特异性引物对待测小麦材料基因组dna进行pcr反应，读取pcr扩增产物的荧光颜色，以判断样品材料基因组中染色体3al上seq id no:1所示的序列的第51位碱基对应的基因型是aa、gg或ag。

25、若所述待测的pcr扩增产物的荧光显示为红色，则代表检测基因型为aa；

26、若所述待测的pcr扩增产物的荧光显示为蓝色，则代表检测基因型为gg；

27、若所述待测的pcr扩增产物的荧光显示为绿色，则代表检测基因型为ag；

28、在某些实施例中，同时选取小麦材料，以seq id no:1所述序列设计普通pcr特异性引物进行扩增，对pcr扩增产物进行测序比较。其引物对如下：

29、上游引物f3，如seq id no:7所示；

30、下游引物r，如seq id no:4所示。

31、qphr-3a-f3：5'-ttgtctaatatgaagcgatcaact-3'；

32、qphr-3a-r：5'-gcgctggtagttgaagacaa-3'。

33、基因型为gg的pcr扩增产物命名为qphr-3agg(氮高效单倍型)，其序列如seq idno:8所示；基因型为aa的pcr扩增产物命名为qphr-3aaa(氮低效单倍型)，其序列如seq idno:9所示。序列如下：

34、qphr-3agg：

35、5'-ttgtctaatatgaagcgatcaactgttttgaactcgttgtcttcaactaccagcgc-3'，

36、qphr-3aaa：

37、5'-ttgtctaatatgaagcgatcaactattttgaactcgttgtcttcaactaccagcgc-3'。

38、本发明的有益效果为：

39、本发明筛选鉴定到一个新的影响小麦材料nue的位点qphr-3a，该位点与小麦nue显著相关。初步分析结果表明，携带gg基因型的小麦材料，其gy、naa和nhi显著高于携带aa基因型。基于该snp位点的等位变异，结合kasp技术，本发明开发了鉴定该位点的特异引物组及其试剂盒。采用本发明的特异引物组及其试剂盒可以检测待测小麦株系、品系或品种的相对nue高低，进行小麦材料的鉴定和筛选，从而为小麦氮高效分子标记辅助育种或分子育种提供技术支撑。