一种表达胆绿素还原酶的基因重组酵母及其在生物合成胆红素中的应用

(一)本发明属于生物合成，具体涉及一种表达胆绿素还原酶的基因重组酵母及其在生物合成胆红素中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、胆红素(bilirubin，cas号635-65-4)是在一些生物体产生的一类胆色素，是由血红素(heme，cas号14875-96-8)在血红素加氧酶(heme oxygenase，简称ho，ec 1.14.99.3)的作用下，将卟啉环氧化断裂而成为胆绿素(biliverdin，cas号114-25-0)，胆绿素进而被胆绿素还原酶(biliverdin reductase，简称bvr，ec l.3.1.24)还原生成胆红素(反应式见附图1)。

2、长期以来，胆红素都被认为是一种对神经系统有害无利的代谢废物，但是近年来，随着对胆红素的系统研究不断深入，人们对它的功能有了更多的认识，发现胆红素具有一系列重要的生理作用，包括抗氧化活性、抗炎、免疫调节、抗病毒、抗增殖活性等；在中医方面，胆红素具有镇静、解热、降压、抗惊厥等作用。

3、胆红素是天然牛黄的主要成分，其含量是评价牛黄品质优劣的重要依据，中国药典(2020版)规定天然牛黄的胆红素含量不低于25.0％。牛黄具有极其重要的药用价值，中国药典中记载的几十种中药方剂使用了牛黄，如牛黄解毒片、安宫牛黄丸、牛黄上清胶囊等。由于天然牛黄来源稀少，为了缓解天然牛黄的资源短缺，我国在上世纪70年代成功研制出人工牛黄和体外培育牛黄，胆红素是它们的主要原料之一，中国药典要求体外培育牛黄中胆红素含量不低于35％，人工牛黄中的胆红素含量不低于0.63％。所以，胆红素是人工牛黄和体外培育牛黄重要原料，国内医药市场需求非常旺盛。

4、目前，胆红素主要是从猪胆汁中提取，但猪胆汁中胆红素含量相当低，含量仅为0.05％左右。由于原料来源和提取得率低的问题，国内市场胆红素一直处于供不应求状态。因此，开发非动物胆汁来源的胆红素生产方法具有重要经济价值和社会意义。

5、近些年来，国内围绕开发非动物胆汁来源的胆红素生产方法开展了较多的研究，如曹晖从牛的肝脏和脾脏中提取含ho和bvr的粗酶液，以血红素为原料酶解制备胆红素，转化率大约为41.7％(底物浓度未知)，该方法的不足是牛肝或脾脏消耗量非常大，使用1kg的牛肝脏或脾脏只能制备1.92g的胆红素[cn 200910021339.9]；张琦利用固定化重组大肠杆菌表达的ho和bvr，以血红素为底物，在辅酶nadph参与下生产胆红素，虽然转化率达到80％，但血红素浓度仅为100μmol/l(0.0617g/l)[cn 201210395683.6]，较低的底物浓度不可能获得较高的产率，而且转化反应需要外加价格较高的nadph；朱俊歌等构建同时表达葡萄糖脱氢酶(gdh)、ho和bvr的重组大肠杆菌，以外源血红素为底物，生物转化法合成胆红素[cn 202210568351.7]，在该专利实施例3中，10ml的转化体系中加入0.01g羟高铁血红素，经重组大肠杆菌转化后，得到了纯度98.3％的胆红素0.85g，产物是底物质量的85倍，显然这一结果存在错误。实际上，由于血红素进入大肠杆菌胞内存在跨膜障碍，这种方法很难实现高效的转化。

6、胆绿素是胆红素的直接前体，同样存在于一些其他动物的组织中，如鸡胆汁、鱼胆汁和鸟类的蛋壳。虽然从动物原料中提取胆绿素，生产成本也相对较高，但如果能将胆绿素转化为胆红素，虽不能大幅度降低胆红素的生产成本，但可以提高胆红素的产能。bvr天然存在于哺乳动物的肝脏和脾脏中，也存在于一些藻类细胞中。利用从动物器官或藻类中提取的bvr用于生物转化，由于这些材料中bvr含量较低，转化反应还需要外源补充nadph，这种方法很难取得较高的转化效率。利用基因重组微生物表达bvr，胞内本身就有nadph，利用活细胞转化胆绿素为胆红素的反应更为有效。

7、目前已有利用表达bvr的重组大肠杆菌转化胆绿素为胆红素的报道，但相比于大肠杆菌，酵母细胞具有生长快，发酵生物量高，外源蛋白表达量高的等优点，所以，如果利用表达bvr的酵母细胞转化胆绿素为胆红素，或许能取得更高转化效率。为此，为了提高以胆绿素为原料生物转化法制备胆红素的效率，本发明构建表达胞内活性bvr的基因重组巴斯德毕赤酵母，以氯化胆绿素为底物生物转化法合成胆红素。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明提供一种表达胆绿素还原酶的基因重组酵母及其在生物合成胆红素中的应用，所述基因重组酵母以巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris，以下简称毕赤酵母)为宿主菌，过表达异源胆绿素还原酶(bvr)，以该基因重组毕赤酵母为催化剂，以氯化胆绿素为底物，生物转化法合成胆红素，具有生产工艺效率高、绿色环保等优点。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种表达胆绿素还原酶的基因重组酵母，所述基因重组酵母以毕赤酵母为宿主菌过表达集胞藻(synechocystis sp.)来源的胆绿素还原酶(bvr)；所述毕赤酵母优选为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)gs115菌株。

4、优选的，所述bvr编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、优选的，所述的基因重组毕赤酵母，按以下步骤构建：

6、(1)基因的合成：依据ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库提供的集胞藻来源bvr基因序列(bvr，accession：cp012832)，两端分别引入ecor i和sal i限制性内切酶位点序列，化学合成基因的dna序列，基因的dna序列见seq id no.1；

7、(2)重组载体的构建：合成的dna序列和质粒载体ppiczb，分别经限制性内切酶ecor i和sal i双酶切后用t4 dna酶连接，获得重组载体ppiczb-bvr，热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子并抽提质粒；抽提的质粒经sac i酶切线性化，割胶纯化回收线性化的重组载体ppiczb-bvr；

8、(3)重组载体转化酵母：制备酵母(优选gs115菌株)感受态细胞，并用电转化将线性化的重组载体ppiczb-bvr同源重组至酵母基因组中，电转化的酵母接种于含有50mg/l博来霉素的ypds平板培养基，30℃培养48h。所述ypds培养基终浓度组成为：酵母浸出粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，山梨糖醇182g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，ph自然；

9、(4)阳性重组子的筛选：从ypds平板上挑取多个单菌落，接种至含50mg/l博来霉素的ypd培养基中，30℃培养24h，随后分别从各菌液中抽提各转化子的基因组，使用5′-aox和3′-aox引物扩增，筛选阳性重组子，获得所述基因重组酵母，编名为毕赤酵母gs115-bvr。所述ypd培养基终浓度组成为：酵母浸出粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，溶剂为水，ph＝7.2；

10、本发明还提供一种所述基因重组酵母在生物转化氯化胆绿素合成胆红素中的应用，所述应用的方法为：(1)基因重组酵母的菌体接种于bmmy培养基中，30℃、200–220r/min诱导表达bvr，获得基因重组酵母的发酵液；(2)步骤(1)获得的基因重组酵母发酵液经4℃、5000–8000r/min离心5min，收集的菌体用发酵液1/5–1/10体积的ph 5.0–6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液重新悬浮，加入甲醇或dmso溶解的氯化胆绿素构成转化体系，于30℃、150–200r/min恒温振荡条件下转化1–3d；(3)转化反应结束后，将转化液离心，收集菌体，烘干，获得含胆红素的干菌体，经分离提取，获得胆红素。

11、进一步，步骤(1)基因重组酵母发酵液按如下方法制备：将甘油水溶液冻存的基因重组酵母(优选毕赤酵母gs115-bvr)菌液，按体积分数2％–3％的接种量，接种于bmgy培养基中，30℃、180–200r/min培养16–18h至od600＝4–8时，将其倒入无菌的离心管中，4℃、5000–8000r/min离心5min，弃上清，加入bmgy培养基1/2体积的bmmy培养基重悬后，倒入无菌三刺锥形瓶中，于30℃、200–220r/min培养3–5d，得od600＝10–12的发酵液。培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％–1.5％的甲醇(优选1％)和/或1.25％–2.5％甲醇摩尔量的山梨糖醇(优选1.25％，1mol/l的水溶液形式加入)。

12、进一步，所述的bmgy培养基终浓度组成：蛋白胨20g/l、酵母浸出粉10g/l、甘油10g/l、无氨基酵母氮源(ynb)13.4g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为ph＝5.0–6.0(优选6.0)、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液。所述的bmmy培养基终浓度组成：蛋白胨20–30g/l、酵母浸出粉10–15g/l、甲醇10–20ml/l、ynb 13.4g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为ph＝5.0–6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液，其中蛋白胨浓度优选20g/l，酵母浸出粉浓度优选10g/l，柠檬酸钠缓冲液的ph优选为6.0。

13、进一步，步骤(2)转化体系中氯化胆绿素的浓度为0.2–0.5g/l，甲醇或dmso溶解的氯化胆绿素浓度为1.0–2.5g/l，在转化体系中的体积百分比为10％–20％(优选20％)。

14、进一步，步骤(3)从基因重组酵母菌体中分离胆红素的方法为：转化反应结束后，转化液于室温下5000–8000r/min离心5min，沉淀加入培养基相同体积的去离子水，振荡悬浮菌体，再次离心收集菌体，重复上述操作一次，得到的湿菌体烘干至恒重(优选85℃)，得干菌体。干菌体中加入以其质量计的50–75ml/g的二氯甲烷，充分振荡后于0℃、200w条件下超声30min，再于室温下8000r/min离心5–10min，收集上清液于45℃下减压浓缩至无馏分流出，残留物中加入与二氯甲烷相同体积的石油醚洗涤2次，固形物于60℃干燥，得胆红素成品。

15、与现有技术相比，本发明提供了一种制备胆红素的新方法，有益效果主要体现在：本发明构建表达bvr基因重组毕赤酵母gs115-bvr工程菌，经过产酶诱导培养后，获得具bvr胞内活性的基因重组酵母。以基因重组酵母的菌体作为生物催化剂，在柠檬酸钠缓冲体系中，加入氯化胆绿素为底物，经过转化反应后，生成的胆红素富集在菌体中。菌体作为胆红素提取的原料，干菌体中胆红素的含量可达0.537％。本发明解决了目前只能从动物胆汁中提取生产胆红素难题，具有较高的生产效率，对提高目前胆红素的产能具有显著效果。