血流感染病原体联检并区分的组合物、试剂盒及用途的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及血流感染相关病原菌病原体的检测，更具体地，涉及洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌和鲍曼不动杆菌的检测。

背景技术：

1、洋葱伯克霍尔德菌（burkholderia cepacia）是院内感染的几种重要条件致病菌之一，通常对健康人体并不致病，多侵袭免疫力低下的个体，常定植于囊性纤维化和慢性肉芽肿患者的肺部，是一种高毒力、高致死性的病原菌。近年来，该菌临床分离率不断增加，且对多种抗生素具有较高的耐药性，临床治疗存在困难。该菌为需氧非发酵、革兰阴性无芽孢杆菌，常见于潮湿土壤、水、植物等，能够在营养缺乏的水中生存和生长，是医院感染的常见病原菌之一，可从医院的自来水、体温表、喷雾器、导尿管等处分离到，同时可以从肺泡灌洗液、痰液、血液、穿刺组织、脓液等各种临床样本中检测到。洋葱伯克霍尔德菌有特殊的黏附素，通过亲密接触或吸入带菌的气溶胶而传播，多侵袭免疫力低下的个体，在重症监护病房（icu）患者中尤其多见。icu患者多有长期卧床、年龄大、免疫功能低下、意识障碍等表现，正常的吞咽、咳嗽等生理反射有不同程度的减弱和消失，痰、血和呕吐物不易排出，加上呼吸道侵入性操作的反复实施，如气管切开、气管插管、呼吸机使用等均是发生洋葱伯克霍尔德菌感染的危险因素。所致病症主要有菌血症、尿路感染、化脓性关节炎、心内膜炎、脑膜炎和呼吸道感染等。

2、粘质沙雷菌（serratia marcescens）是医源性感染的重要条件致病菌，细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。革兰氏阴性，周身鞭毛，能运动。无荚膜，无芽胞，约半数菌株能产生红色的灵菌素(prodigiosin)。广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，常黏附在病房环境、医疗设备、植入导管及医务人员手上。也可从痰液、尿液、脓液、伤口分泌物、胸腹水、胆汁、引流液、咽拭子和血液等各种临床样本中检测到。易引起院内流行性感染，该菌可导致败血症、菌血症、血流感染、脑膜炎、心内膜炎、心肌炎、肺炎、蜂窝组织炎、伤口感染、腹膜炎、角膜炎、眼内炎、尿路感染、脓胸、胆囊炎、关节炎、骨髓炎、坏死性筋膜炎、感染性休克、化脓性甲状腺炎、积脓症、硬脊膜外脓肿、绒毛膜羊膜炎、脓肿等疾病。老年病科、呼吸内科及重症监护室是粘质沙雷菌检出的主要病区。粘质沙雷菌对多种药物如氨苄西林、阿莫西林、大环内酯、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、头霉素类等天然耐药并且生命力顽强，使其所造成的感染更为频繁，临床治疗也更为困难。近年来其对碳青霉烯类抗菌药物（如美罗培南、厄他培南等）的耐药率也在增高。

3、鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii）为不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。该菌在医院环境中分布很广且可以长期存活，极易造成危重患者的感染，因此常从被感染患者的血、尿、脓液及呼吸道分泌物等标本中分离出，在非发酵菌中感染仅次于假单胞菌。鲍曼不动杆菌的感染在逐渐增多，且其耐药性日益严重，已引起临床和微生物学者的严重关注。鲍曼不动杆菌主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。鲍曼不动杆菌在医院的环境中分布很广且可长期存活，对危重患者和ccu及icu中的患者威胁很大，也将此类感染称做icu获得性感染。

4、上述洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌和鲍曼不动杆菌均可引起脓毒症或菌血症，危机生命安全，因此早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的细菌种类，而且目前细菌培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，且多重混合感染的培养极为困难，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。

5、因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且灵敏度高，特异性好。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种血流感染病原体联检并区分的组合物，包括：

2、如seq id no:1~3所示的检测洋葱伯克霍尔德菌的上游引物、下游引物及探针；

3、如seq id no:4~6所示的检测粘质沙雷菌的上游引物、下游引物及探针；以及如seq id no:7~9所示的检测鲍曼不动杆菌的上游引物、下游引物及探针。

4、本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/ml，特异性好，检测更为准确。

5、进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。

6、在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是rnase p。

7、进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

8、在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

9、在一些具体的实施方案中，洋葱伯克霍尔德菌探针的荧光报告基团为fam；鲍曼不动杆菌探针的荧光报告基团为hex（或vic）；粘质沙雷菌探针的荧光报告基团为rox。

10、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

11、本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

12、举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。

13、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。

14、进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

15、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。

16、在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。

17、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

18、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

19、进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

20、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备血流感染病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌。

21、第三方面，本发明提供了一种血流感染病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

22、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

23、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌的片段质粒或片段dna中的至少一种。

24、进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

25、更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及dna聚合酶中的至少一种。

26、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶（udg）、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

27、进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应~15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。

28、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括taq酶、mg2+、dntp（u）s、引物、探针和pcr缓冲液。

29、常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20µl~ 200µl。

30、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。

31、第四方面，提供了一种用于非诊断目的的血流感染病原体联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：

32、1）提取或释放待测样本的核酸；

33、2）使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量pcr；

34、3）获得并分析结果。

35、在本发明中，用于检测的样本可以是血液、血浆等，但不限于此。还可以是肺泡灌洗液、痰液、穿刺组织、脓液、伤口分泌物等等。

36、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

37、dna预变性，温度为95℃，时间为1~3 min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5~20秒，退火，温度为55℃~60℃，时间为10~60秒，30~50次循环，采集荧光。

38、在一个具体的实施方案中，提供了一种用于制备血流感染病原体联检并区分的组合物的用途，所述联检包括以下步骤：

39、1）提取或释放待测样本的核酸；

40、2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量pcr；

41、3）获得并分析结果。

42、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

43、dna预变性，温度为95℃，时间为1~3 min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5~20秒，退火，温度为55℃~60℃，时间为10~60秒，30~50次循环，采集荧光。

44、在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患血流感染的信息。例如，该方法可以在检测培养物中（例如血液）需求检测是否有上述病原体。