检测BRAF基因突变的引物探针组及其试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，具体涉及检测braf基因突变的引物探针组及其试剂盒。

背景技术：

1、braf基因是一种原癌基因，位于第七号染色体的长臂上，编码b-raf蛋白。b-raf与kras蛋白同为ras-raf-mek活化的细胞外信号调节激酶，在mapk/erk信号通路中起着关键作用。b-raf蛋白是一种766个氨基酸的调节信号转导丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，是生长信号转导蛋白激酶的raf激酶家族的成员，该蛋白主要在调节map激酶/erks信号通路中起作用，影响细胞分裂，分化和分泌。braf基因突变通常发生在蛋白激酶激活区域，主要包括点突变、小片段缺失、扩增、基因融合等，其中点突变主要位于cr3激酶结构域的第11外显子及第15外显子，其中最常见的突变形式为第15外显子的braf v600e、v600k、v600r三种突变。这一突变可使braf蛋白持续激活，提高braf活性约500倍，从而导致了细胞的无限增殖和分裂。

2、braf基因对于正常细胞的生长至关重要，但不受抑制的braf信号传导会促进肿瘤的发生发展。当braf基因突变，kras/akt通路过度激活，细胞循环紊乱，检查点相关通路异常，肿瘤细胞过度增殖，同时参与调控影响上皮间充质转换，影响机体免疫反应。因此，braf基因突变也预示着不良预后。目前市场上braf基因突变检测方法和试剂盒多针对brafv600e突变，方法包括探针法或测序法，其中探针法检测突变种类单一，测序法程序复杂、耗时长。并且目前市场上尚没有能够针对braf基因600位密码子多种热点突变、能精准分型、操作简单、成本又低的检测方法和试剂盒。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测braf基因突变的引物探针组及其试剂盒。本发明提供的引物探针组及其试剂盒能够检测braf基因600密码子3种热点突变，能够应用到braf基因突变的临床检测中。

2、本发明提供了检测braf基因突变的引物探针组，其包括braf基因扩增引物对和/或braf基因突变位点探针；

3、所述braf基因扩增引物对中，上游引物具有如seq id no:1所示的核苷酸序列，下游引物具有如seq id no:2所示的核苷酸序列；

4、所述braf基因三个突变位点的探针分别具有如seq id no:3～5任一项所示的核苷酸序列。

5、本发明提供的检测braf基因突变的引物探针组，所述探针修饰有荧光基团；所述荧光基团选自fam、vic、rox和/或cy5。具体的，在一些实施例中，所述检测v600e突变的探针修饰有vic荧光基团，检测v600k突变的探针修饰有rox荧光基团，检测v600r突变的探针修饰有cy5荧光基团。

6、进一步的，本发明所述的检测braf基因突变的引物探针组，还包括检测braf基因突变的pna；所述pna具有如seq id no:6所示的核苷酸序列。

7、利用本发明提供的引物探针组对临床样本进行braf基因600密码子3种突变的荧光pcr检测，结果表明本发明的检测结果与传统测序方法的结果符合率为100％，对不同突变细胞系样本进行检测，结果表明本发明的引物探针组具有特异性，并且灵敏度高于传统测序方法。相较于其他引物、探针序列，本发明提供的引物探针组在灵敏度和特异性方面更有优势。

8、本发明通过查找braf基因，获取braf基因600密码子的突变位点并设计了8对特异性突变位点引物，通过荧光pcr反应验证上下游引物是否合格，以确定braf基因扩增的最佳上、下游引物。所述检测突变位点的三个探针修饰有荧光基团，可以根据反应的荧光信号来判断检测结果。所述pna为肽核酸，是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物，常用于抑制基因表达，也可用于定量pcr。本发明中的所述pna是抑制野生型braf基因600密码子扩增的pna。相对于其他pna序列，本发明采用的pna更有利于抑制野生型braf基因600密码子扩增，提高反应结果的准确率。

9、本发明提供了所述的检测braf基因突变的引物探针组在制备检测braf基因600密码子3种突变的试剂或试剂盒中的应用。

10、具体的，所述braf 600密码子3种突变包括v600e、v600k和/或v600r。

11、本发明提供了检测braf基因600密码子3种突变的试剂盒，包括本发明所述的引物探针组。

12、进一步的，本发明所述试剂盒还包括内参基因扩增引物对和/或内参基因探针；

13、所述内参基因扩增引物对中，上游引物具有如seq id no:7所示的核苷酸序列，下游引物具有如seq id no:8所示的核苷酸序列；

14、所述内参基因探针具有如seq id no:9所示的核苷酸序列。

15、更进一步的，所述试剂盒还包括v600e阳性质控品、v600k阳性质控品、v600r阳性质控品和/或阴性质控品。

16、具体的，在一些实施例中，本发明所述的试剂盒包括braf基因600密码子3种突变和内参基因的引物探针组、pna和质控品。其中，所述引物的浓度为1～10pmol/μl，所述探针的浓度为5～10pmol/μl，所述pna的浓度为5～10pmol/μl；所述质控品的浓度为0.1～50ng/μl。

17、braf基因编码一种丝氨酸/苏氨酸特异性激酶，其激活突变对肿瘤的生长增殖和侵袭转移有很大影响。其中v600突变发生在多种肿瘤中，包括黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、胆管癌、卵巢癌、胰腺癌或一些罕见病，因此本发明提供的检测braf基因600密码子3种突变的引物探针组及其试剂盒在多种肿瘤疾病的临床检测中具有广泛的应用前景。

18、本发明还提供了一种非诊断目的的检测braf基因600密码子3种突变的方法，其包括利用本发明所述的试剂盒进行荧光pcr反应，其反应程序为95℃5min，95℃10s，60℃30s，40个循环。

19、具体的，在一些实施例中，本发明所述的检测样本中braf基因600密码子3种突变的方法包括以下步骤：

20、s1、提取检测样本中基因组dna；所述样本包括血浆、新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片；

21、s2、以待检测样品的dna作为模板，使用本发明提供的引物探针组或试剂盒进行荧光pcr反应绘制扩增曲线；所述荧光反应程序为95℃5min，95℃10s，60℃30s，40个循环；

22、s3、根据荧光pcr扩增仪显示的ct值判断检测结果。

23、本发明提供的方法可为诊断目的的，也可为非诊断目的的。例如，包括对人体或动物体，或者离体的来自于人体或动物体的样品进行的以诊断为目的的检测方法；也包括对环境样品或者模拟样品进行的以科研或其他非诊断目的检测方法。

24、本发明提供的检测3种braf基因密码子突变的引物探针组灵敏度高、特异性强、重复性高、稳定性好且能够精准分型，利用该引物探针组制备的试剂盒价格低廉，操作简单，适用于临床上黑色素瘤、非小细胞肺腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤等肿瘤组织的浸润淋巴细胞(til)治疗、靶向治疗、免疫治疗和多肽疫苗治疗的伴随诊断，能够为个体化用药提供参考。