一种基于氨基化改性硅藻土固定D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法

本发明涉及一种基于氨基化改性硅藻土固定d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，属于酶工程。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量甜味剂；因具有较高的甜度和较低的能量，d-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品，可用于开发低热量食品和饮料。同时，d-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质。此外，d-阿洛酮糖还具有多种生理功能，具有较大的潜在应用价值，例如d-阿洛酮糖可抑制肠道α-葡糖苷酶活性，防止血糖升高；可减小脂肪合酶活性，降低血脂；同时还对神经具有保护作用。然而，d-阿洛酮糖非常稀缺，在自然界中很难提取。因此，有必要利用生物技术对d-阿洛酮糖进行生产，以满足日益增长的市场需求。

2、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以催化多种酮糖c3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，能够以d-果糖为底物生产附加产值高的d-阿洛酮糖。但在工业生产中d-阿洛酮糖-3-差向异构游离酶的活性大幅度降低、稳定性差、不可重复使用、跟产品分离困难，这些缺点大大降低了游离酶在实际生产中的应用。

3、因此，开发d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定化技术，增加酶稳定性的同时使酶可以反复多次使用，在降低成本的基础上可进行d-阿洛酮糖的连续生产，对阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。

4、目前，d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定化多采用阴离子交换树脂作为载体，但通常得到的固定化酶的酶活偏低，生产效率不高。此外，金属有机骨架材料和二氧化钛也被用于d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定化，这些生物催化剂具有良好的操作稳定性，但这些材料的成本较高。近年来，现有固定化酶的技术多以海藻酸钠作为固定化的载体，海藻酸钠在高浓度的电解质溶液中性质不够稳定，容易变软，不利于d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工业应用。

5、硅藻土的化学成分主要为二氧化硅，可作为催化剂载体，它具有硅藻锥孔化石组合的多孔和中空结构，具有高孔隙率、低成本、高可重复利用性和化学稳定性。硅藻土表面具有羟基官能团，其在吸附过程中主要起到吸附作用。为进一步增加硅藻土的吸附性能和稳定性，通常对硅藻土进行改性来提高其吸附性能。如中国专利cn111440785a公开了一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，通过对天然硅藻土改性得到改性硅藻土，来对葡萄糖异构酶湿菌体进行固定化；但该改性硅藻土是对湿菌体进行的固定，并且仍然存在固定化效率低、固定化酶酶活低的情况。

6、因此，迫切需要找到一种简单、高效、低成本、机械性能稳定的适合d-阿洛酮糖-3-差向异构酶工业化生产的固定化方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供了一种基于氨基化改性硅藻土固定d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，该方法使得固定化d-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有较高的酶活和稳定性，可多次重复利用，从而降低酶法生产d-阿洛酮糖的成本。

2、本发明的目的是提供一种基于氨基化改性硅藻土固定d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，所述方法包括如下步骤：

3、(1)硅藻土改性

4、将天然硅藻土加入到浓度为1～5mol/l的h2so4溶液中，搅拌一定时间后进行超声处理，然后用去离子水洗涤至中性，抽滤，干燥、过筛，即得到改性硅藻土；

5、(2)氨基化改性硅藻土载体制备

6、将步骤(1)获得的改性硅藻土置于溶剂中，并加入氨基化试剂，振荡反应，反应结束后洗涤，即得氨基化改性的硅藻土载体；

7、(3)d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定

8、将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶解于tris-hcl缓冲溶液中形成酶液；先在酶液中加入交联剂进行交联反应，形成酶液加成物；然后再加入步骤(2)制备的氨基化改性的硅藻土载体进行固定反应，反应结束后，洗涤、干燥，即得到固定化酶成品。

9、在一种实施方式中，步骤(1)所述硅藻土与h2so4溶液的料液比1:10～30；g/ml。

10、在一种实施方式中，步骤(1)所述搅拌一定时间为4～6小时。

11、在一种实施方式中，步骤(2)所述溶剂包括水溶液、无水乙醇、酸溶液和碱溶液中的任一种。

12、在一种实施方式中，步骤(2)所述改性硅藻土与溶剂的料液比为1:10～100；g/ml。

13、在一种实施方式中，步骤(2)所述氨基化试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基(二乙氧基)甲基硅烷、壳聚糖、聚乙二胺、聚二乙烯三胺、聚乙醇胺、聚乙烯亚胺中的任一种。

14、在一种实施方式中，步骤(2)中当氨基化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷选择的溶剂为无水乙醇；当氨基化试剂为壳聚糖，选择的溶剂为弱酸溶液；当氨基化试剂为聚乙烯亚胺时，选择的溶剂为碱溶液。

15、在一种实施方式中，步骤(2)所述氨基化试剂添加的质量浓度为1～15％。

16、在一种实施方式中，步骤(2)所述振荡反应条件是：15～50℃，100～400r恒温振荡1～72h。

17、在一种实施方式中，步骤(3)所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于：产d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌分别接种至lb液体培养基中，于37℃、200rpm培养12h，得到一级种子液；将种子液以体积浓度3％接种量接种至二级种子培养基，37℃，200rpm培养12h，获得二级种子液；将二级种子液以体积浓度3％接种量接种至发酵培养基，37℃、200rpm条件下培养12h，取发酵液离心，收集湿菌体，用50mm tris-hcl缓冲溶液(ph＝7.5)重悬菌体后用20mg/ml的溶菌酶溶液处理破酶，离心上清过膜后即为粗酶液，将粗酶液冷冻干燥，即得酶粉。

18、在一种实施方式中，步骤(3)所述交联剂为双醛淀粉，聚乙二醇二缩水甘油醚，京尼平，辛二酸二琥珀酰亚胺酯，戊二醛中的任一种。

19、在一种实施方式中，步骤(3)所述交联剂在酶液体系中的体积浓度为0.01～1％(v/v)，交联反应的时间为0.1-24h。

20、在一种实施方式中，步骤(3)所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶是以酶液的形式加入到反应体系中，酶液中酶的浓度为1～40mg/ml；氨基化改性硅藻土载体与酶在反应体系中的添加量比例为：每10～100mg酶对应加入1～3g氨基化改性硅藻土载体。

21、在一种实施方式中，步骤(3)所述固定反应条件为：4～30℃，100～300r恒温振荡1～48h。

22、在一种实施方式中，步骤(2)和步骤(3)还可以包括：

23、步骤(2)氨基化改性硅藻土载体制备

24、将步骤(1)制备的改性硅藻土于无水乙醇溶液中，加入氨基化试剂恒温振荡；然后再加入交联剂溶液，恒温振荡反应；取出样品后，用去离子水清洗3～5次，即获得氨基化改性的硅藻土载体；

25、步骤(3)d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定

26、将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶解于tris-hcl缓冲溶液中，形成酶液，然后加入步骤(2)得到的氨基化硅藻土载体，恒温振荡进行固定化反应，反应结束后，用去离子水清洗多次后，自然干燥，即得到固定化酶成品。

27、在一种实施方式中，所述氨基化试剂为聚乙烯亚胺。

28、本发明的第二个目的是提供一种由上述所述方法制备得到的固定化d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

29、本发明的第三个目的是提供一种上述所述方法在制备固定化d-阿洛酮糖-3-差向异构酶中的应用。

30、本发明的第四个目的是提供一种提高固定化d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活的方法，所述方法包括如下步骤：

31、(1)硅藻土改性

32、将天然硅藻土加入到浓度为1～5mol/l的h2so4溶液中，搅拌一定时间后进行超声处理，然后用去离子水洗涤至中性，抽滤，干燥、过筛，即得到改性硅藻土；

33、(2)氨基化改性硅藻土载体制备

34、将步骤(1)获得的改性硅藻土置于溶剂中，并加入氨基化试剂，振荡反应，反应结束后洗涤，即得氨基化改性的硅藻土载体；

35、(3)d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定

36、将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶解于tris-hcl缓冲溶液中形成酶液；先在酶液中加入交联剂进行交联反应，形成酶液加成物；然后再加入步骤(2)制备的氨基化改性的硅藻土载体进行固定反应，反应结束后，洗涤、干燥，即得到固定化酶成品。

37、本发明的有益效果：

38、本发明提供的固定化d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，简单高效，经济实用。采用该方法制备的固定化d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活能够达到1168.98u/g，并且回收率高，达到64.94％，蛋白固载率为52.96％，在工业应用中具有很大的潜力。