一种用于检测PD-L1的免疫组化抗体及其应用的制作方法

本发明涉及疾病诊断领域，特别是生物药物伴随诊断领域，具体涉及用于检测pd-l1的免疫组化抗体及其应用。

背景技术：

1、pd-l1（programmed death ligand 1）是程序性死亡受体配体1，是pd-1（programmed cell death 1，程序性死亡受体1）的配体。pd-1属于细胞膜上的一个跨膜蛋白，表达在t细胞、b细胞等免疫细胞以及肿瘤细胞上，研究表明当肿瘤细胞膜上的pd-l1与t细胞等免疫细胞上的pd-1结合后，肿瘤细胞发出抑制性信号，进而t细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制，肿瘤继续肆意生长和侵袭。

2、免疫检查点抑制剂可以与pd-1或pd-l1结合，阻断肿瘤细胞对免疫功能的控制，保证t细胞等免疫细胞的功能，重拾t细胞对肿瘤的清除作用。因此，如果肿瘤细胞含有大量的pd-l1，肿瘤患者可能会获益于免疫检查点抑制剂的治疗。免疫疗法可增强患者的免疫系统以帮助其识别并抵抗肿瘤细胞，它往往比其他的治疗方法具有更少的副作用。

3、免疫组化(immunohistochemistry，ihc)，是应用免疫学抗原抗体反应的基本原理，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。

4、pd-l1免疫组化（ihc）检测是预测pd-1或pd-l1疗效的一种简单有效的方法，它是通过检测肿瘤细胞（tc）或免疫细胞（ic）表面的pd-l1表达量，进而推测pd-l1抑制剂疗效的方法。

5、本领域公开了一些用于检测的免疫组化抗体。比如，专利文献1（cn110531077a，公开日2019.12.03）公开了及一种间皮素( mesothelin，msln )免疫组化检测试剂盒，其含有msln单克隆抗体3-2g6。专利文献2（cn111670201a，公开日2020.09.15）公开了一种人表皮生长因子受体2(her2)伴随诊断免疫组化检测(ihc)用抗体，该抗体作为一抗对样品的her2表达情况进行免疫组化检测时，能够避免因胞外区缺失导致的检测结果的假阳性。本领域公开了诊断用抗pd-l1抗体，专利文献3（cn109963872b，公开日2023.04.11）公开了诊断抗pd-l1抗体及其用途，所述抗pd-l1抗体以高特异性和可重复性结合人pd-l1内的表位，可用于评估组织样品中的pd-l1表达，以帮助患者分层。专利文献4（cn106604933b，公开日2021.08.10）公开了抗pd-l1抗体及其诊断用途，所述抗体制造供一种检测来自受试者的生物样品中pd-l1的存在或表达水平的方法使用的试剂或试剂盒的用途。

6、目前，pd-l1常用免疫组化检测抗体主要有五种：22c3、28-8、sp263、sp142和73-10。但是鉴于pd-1/pd-l1靶点免疫治疗的广泛应用和潜在巨大市场需求，本领域亟需其他的特异性强、灵敏性高的pd-l1免疫组化抗体。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种特异性强、灵敏度高、且免疫组化背景染色更低的用于检测pd-l1的免疫组化抗体，所述抗体可广泛用于体外检测pd-l1中的用途，制备检测pd-l1的体外诊断试剂，以及用于制备靶向药物治疗前配套的pd-l1伴随诊断免疫组化检测产品。本发明还提供编码所述抗体的核酸，包含其的载体、宿主细胞、用于检测pd-l1的免疫组化抗体组合物或试剂盒以及应用等。

2、本发明的一个方面提供一种结合pd-l1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含3个重链互补决定区cdrs和3个轻链互补决定区cdrs，其中，hcdr1氨基酸序列如seq id no:1所示，hcdr2氨基酸序列如seq id no:2所示，hcdr3氨基酸序列如seq id no:3所示，lcdr1氨基酸序列如seq id no:4所示，lcdr2氨基酸序列如seqid no:5所示，lcdr3氨基酸序列如seq id no:6所示。

3、具体而言，所述cdrs序列如下：

4、hcdr1：gftfasswih (seq id no:1)；

5、hcdr2：awispfggsnyyddsvkg(seq id no:2)；

6、hcdr3：rhwpssfdy(seq id no:3)；

7、lcdr1：rasqsidtaln(seq id no:4)；

8、lcdr2：tasllqs(seq id no:5)；

9、lcdr3：qqdnltpmt(seq id no:6)；

10、所述cdrs序列由kabat定义确定。

11、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如seq id no:7所示的重链可变区，和氨基酸序列如seq id no:8所示的轻链可变区。

12、具体而言，所述可变区序列如下：

13、重链可变区（vh）序列：

14、evqlvesggglvqpggslrdscaasgftfasswihwvrqapgkglewvawispfggsnyyddsvkgrftisadtsknttylqmnslraedtavyycarrhwpssfdyweqgtlvtvss（seq id no:7）。

15、轻链可变区（vl）序列：

16、diqmtqspsslsasvgdvvtitcrasqsidtalnwyqqkpgkkpklliytasllqsgvpsrfsgsgsgtdftltisllqpedfatyycqqdnltpmtfgqgtkveik（seq id no:8）。

17、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如seq id no:17所示的重链恒定区，和氨基酸序列如seq id no:18所示的轻链恒定区。

18、具体而言，所述恒定区序列如下：

19、重链恒定区（ch）序列：

20、gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflysklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk（seq id no:17）。

21、轻链恒定区（cl）序列：

22、gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc（seq id no:18）。

23、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv或dsfv片段。

24、本发明的另一方面提供一种分离的核酸，其特征在于，编码所述的抗体或抗原结合片段。

25、本发明的另一方面提供一种载体，其特征在于，包含所述的核酸。

26、本发明的另一方面提供一种宿主细胞，其特征在于，包含所述的核酸或所述的载体。

27、本发明的另一方面提供一种用于检测pd-l1的免疫组化抗体组合物或试剂盒，其特征在于，包含所述抗体或其抗原结合片段。

28、进一步地，所述组合物或试剂盒还包含以下组分中的一种或多种：抗体稀释液，蛋白保护液，表面活性剂液，防腐剂。

29、本发明另一方面，提供一种所述抗体或抗原结合片段在制备检测pd-l1的免疫组化试剂盒或制备靶向药物治疗前配套的pd-l1伴随诊断免疫组化检测产品中的应用。

30、本发明另一方面，提供一种非诊断目的的检测pd-l1表达的方法，其特征在于，采用所述抗体或抗原结合片段，或所述免疫组化抗体组合物或试剂盒检测生物样本。

31、本发明的用于检测pd-l1的免疫组化抗体具有以下有益效果：

32、（1）本发明通过噬菌体展示技术，最终筛选获得检测pd-l1的适用于免疫组化实验的特异性强、灵敏度高的单克隆抗pd-l1抗体hd066。

33、（2）对于免疫组化抗体特异性，本发明的抗pd-l1抗体hd066、hd078与市售阳性对照抗体22c3具有类似的特异性，均能识别pd-l1阳性黑色素瘤组织，但是市售阳性对照抗体22c3的非特异性染色较深。

34、（3）对于免疫组化抗体灵敏性，与阳性对照组1μg/ml浓度相比，本发明的抗pd-l1抗体hd066和hd078采用更低的抗体浓度0.5μg/ml，仍能有效识别pd-l1阳性黑色素瘤组织，灵敏度高于市售阳性对照抗pd-l1抗体22c3。并且，抗体hd066与抗体hd078灵敏度类似，但抗体hd066背景染色更少。

35、（4）本发明最终筛选确定抗体hd066用于作为检测pd-l1的免疫组化抗体，其可广泛用于体外检测pd-l1中的用途，制备检测pd-l1的体外诊断试剂，以及用于制备靶向药物治疗前配套的pd-l1伴随诊断免疫组化检测产品，在医药领域具有广泛的应用前景。