一种基于双重显色的核酸检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种基于双重显色的核酸检测试剂盒及其应用，属于生物检测。

背景技术：

1、由于单细胞成像技术的的发展，使得单个rna分子的亚细胞原位可视化成为可能。目前单分子rna检测方法基于荧光信号的原位成像技术，例如：单分子荧光原位杂交(smfish)、基于支链dna(bdna)的技术，滚环扩增(rca)的方法等。但是荧光检测容易受到光漂白的影响，并且组织中的自发荧光会导致信背比较低。因此酶促显色分析可以作为荧光检测的替代方法，在保留检测特异性和单分子灵敏度的同时，避免自发荧光的产生。此外染色样品在经固定后可以长期保存，并且在普通光学显微镜下即可观察到细胞或组织中目标rna的空间信息。

2、使用bdna或者rca的扩增方法也非常适用于mrna的显色反应。例如，基于rca扩增的方法，通过辣根过氧化物酶(hrp)催化底物显色，原位可视化单细胞中单个mrna。但是使用hrp进行显色反应的rca扩增方法只能检测到单一靶点，且产生棕色沉淀并不适用于黑色素瘤等黑色素沉着组织。而基于bdna扩增开发的rnascope技术，可以做到靶向单细胞中两种不同的mrna，实现对双重靶标同时检测。但是rnascope需要结合多个探针，通过多轮杂交来产生可见信号，过程复杂，需要投入大量的成本和劳动力。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种基于双重显色的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括锁式探针杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂、第一显色试剂和第二显色试剂；所述锁式探针杂交试剂包括第一锁式探针组和第二锁式探针组；所述第一锁式探针组和第二锁式探针组能够分别与第一靶标核酸和第二靶标核酸特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂用于将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂包括滚环扩增引物组；所述滚环扩增引物组包括第一扩增引物和第二扩增引物；所述第一扩增引物和第二扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合，并且，所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一标记物和第二标记物；所述第一显色试剂和第二显色试剂能够分别与第一标记物和第二标记物发生显色反应。

2、在本发明的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒还包括染色剂以及封片剂；所述封片剂为水溶性封片剂。

3、在本发明的一种实施方式中，所述第一标记物和第二标记物分别为第一显色酶和第二显色酶，所述第一显色试剂包含第一显色酶的显色底物，所述第二显色试剂包含第二显色酶的显色底物；

4、或者，所述第一标记物为第一显色酶，所述第二标记物为偶联中间体，所述偶联中间体用于将第二显色酶偶联在第二检测探针上，所述第一显色试剂包含第一显色酶的显色底物，所述第二显色试剂包含第二显色酶以及第二显色酶的显色底物；

5、或者，所述第一标记物为为偶联中间体，所述第二标记物为第二显色酶，所述偶联中间体用于将第一显色酶偶联在第一检测探针上，所述第一显色试剂包含第一显色酶以及第一显色酶的显色底物，所述第二显色试剂包含第二显色酶的显色底物。

6、在本发明的一种实施方式中，所述第一显色酶为碱性磷酸酶(alp)；所述第一显色酶的显色底物包括固红(fastred)和萘酚(naphthol)；所述第二显色酶为辣根过氧化物酶(hrp)；所述第二显色酶的显色底物包括二氨基联苯胺(dab)。

7、在本发明的一种实施方式中，所述染色剂包括苏木素、美蓝和/或结晶紫。

8、在本发明的一种实施方式中，所述锁式探针环化试剂包括dna连接酶；所述dna连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物。

9、在本发明的一种实施方式中，所述dna连接酶为splintr连接酶。

10、在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增试剂包括dntps和dna聚合酶；所述dntps能够在dna聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物。

11、在本发明的一种实施方式中，所述dna聚合酶为phi29聚合酶。

12、在本发明的一种实施方式中，所述偶联中间体为生物素和/或链霉亲和素。

13、在本发明的一种实施方式中，所述锁式探针杂交试剂中，第一锁式探针组的浓度为0.1～0.5μm，第二锁式探针组的浓度为0.1～0.5μm。

14、在本发明的一种实施方式中，所述锁式探针环化试剂中，dna连接酶的浓度为0.2～1u/μl。

15、在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增引物杂交试剂中，滚环扩增引物组的浓度为0.1～0.5μm。

16、在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增试剂中，dntps的浓度为0.5～2mm，dna聚合酶的浓度为0.5～2u/μl。

17、在本发明的一种实施方式中，所述检测探针杂交试剂中，第一检测探针的浓度为0.1～0.5μm，第二检测探针的浓度为0.1～0.5μm。

18、在本发明的一种实施方式中，所述第一显色试剂中，第一显色酶的浓度为1～5μm。

19、在本发明的一种实施方式中，所述第二显色试剂中，第二显色酶通过偶联中间体偶联在第二检测探针上，浓度为0.1～0.5μm。

20、在本发明的一种实施方式中，所述偶联中间体包括生物素和/或链霉亲和素。

21、本发明还提供了一种基于双重显色的核酸检测方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述检测方法使用上述核酸检测试剂盒对待测样本进行检测。

22、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

23、透化步骤：在待测样本上先滴加酸性溶液进行透化孵育，再分别滴加第一显色酶阻断剂和第二显色酶阻断剂进行阻断孵育；

24、锁式探针杂交步骤：

25、在透化步骤所得待测样本上滴加锁式探针杂交试剂进行孵育；

26、锁式探针环化步骤：

27、在锁式探针杂交步骤所得待测样本上滴加锁式探针环化试剂进行孵育；

28、滚环扩增引物杂交步骤：

29、在锁式探针环化步骤所得待测样本上滴加滚环扩增引物杂交试剂进行孵育；

30、滚环扩增步骤：

31、在滚环扩增引物杂交步骤所得待测样本上滴加滚环扩增试剂进行孵育；

32、检测探针杂交步骤：

33、在滚环扩增步骤所得待测样本上滴加检测探针杂交试剂进行孵育；

34、显色反应步骤：

35、在检测探针杂交步骤所得待测样本上分别滴加第一显色试剂和第二显色试剂进行孵育；

36、染色及封片步骤：

37、在显色反应步骤所得待测样本上依次滴加染色剂和封片剂后，观察待测样本产生的信号点；根据待测样本产生的信号点对待测样本中的第一靶标核酸和第二靶标核酸进行定量。

38、在本发明的一种实施方式中，透化步骤中，滴加酸性溶液后的透化孵育时间为10～15min。

39、在本发明的一种实施方式中，透化步骤中，滴加酸性溶液后的透化孵育时间为10min。

40、在本发明的一种实施方式中，所述酸性溶液包括盐酸。

41、在本发明的一种实施方式中，所述酸性溶液为浓度0.05～2m的盐酸。

42、在本发明的一种实施方式中，所述染色及封片步骤为：在显色反应步骤所得待测样本上先滴加染色剂进行染色，再滴加封片剂进行烤干后，观察待测样本产生的信号点；根据待测样本产生的信号点对待测样本中的第一靶标核酸和第二靶标核酸进行定量。

43、在本发明的一种实施方式中，所述染色及封片步骤为：在显色反应步骤所得待测样本上先滴加染色剂进行染色，再滴加封片剂进行烤干后，通过光学显微镜观察待测样本产生的信号点；通过cellprofiler或qupath软件根据待测样本产生的信号点对待测样本中的第一靶标核酸和第二靶标核酸进行定量分析。

44、本发明还提供了上述核酸检测试剂盒或上述核酸检测方法在靶标核酸检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

45、本发明技术方案，具有如下优点：

46、本发明提供了一种基于双重显色的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括锁式探针杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂、第一显色试剂和第二显色试剂；所述锁式探针杂交试剂包括第一锁式探针组和第二锁式探针组；所述第一锁式探针组和第二锁式探针组能够分别与第一靶标核酸和第二靶标核酸特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂用于将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂包括滚环扩增引物组；所述滚环扩增引物组能够与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合，并且，所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一标记物和第二标记物；所述第一显色试剂和第二显色试剂能够分别与第一标记物和第二标记物发生显色反应。所述核酸检测试剂盒基于双重rna原位显色原理，首先设计两条锁式探针分别与固定的细胞或者组织样本中的目标rna靶序列进行杂交，接着通过连接酶将锁式探针环化，经过滚环扩增后得到扩增产物，将两种不同的检测探针与扩增产物杂交，并且分别加入两种不同的底物，alp催化萘酚水解产物与固红发生反应，产生红色的沉淀，hrp催化底物二氨基联苯胺产生棕色沉淀，两种颜色的信号点易于区分，在光学显微镜下即可观察到，即所述核酸检测试剂盒能够以单细胞分辨率对两个基因的mrna进行高选择性和灵敏的单分子检测，并且在光学显微镜下可以直接观察。研究表明，使用所述核酸检测试剂盒可以在小鼠嗅球组织中检测到颜色分层的doc2g(肾小球层)、penk(颗粒细胞层)基因，区域性效果很好，并且，可以在宫颈腺癌组织中实现hpv18e6/e7、mki67基因共定位，相比于检测p16ink4a、ki67蛋白的常规免疫组化，使用所述核酸检测试剂盒的hpv18e6/e7、mki67基因双重检测显示出更好的特异性和更高的灵敏度。因此，所述核酸检测试剂盒可以应用于量化单细胞和多种细胞类型中原位检测两个基因的mrna表达。

47、进一步地，所述核酸检测试剂盒基于碱性磷酸酶(alp)和辣根过氧化物酶(hrp)的双重rna原位显色原理，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶经显色反应后的两种颜色的信号点易于区分，在光学显微镜下能够很容易的观察和分辨。

48、进一步地，使用所述核酸检测试剂盒进行靶标核酸检测时，选择在盐酸透化后进行内源性阻断，并将透化时间控制为10min，此透化时间下信号点达到饱和且不至于胞内杂质颗粒流出。

49、进一步地，使用所述核酸检测试剂盒进行靶标核酸检测时，在滴加水溶性封片剂后烤干，这种封片方式检测效果最佳。

50、进一步地，以hpv18e6/e7基因的mrna为第一靶标核酸，以mki67基因的mrna为第二靶标核酸时，所述第一锁式探针组由核苷酸序列分别如seq id no.12、13、16所示的plp-mki67-1、plp-mki67-2和/或plp-mki67-5组成，所述第二锁式探针组由核苷酸序列分别如seq id no.21～23所示的plp-hpv18e7-1、plp-hpv18e7-2和/或plp-hpv18e7-3组成，此锁式探针下对mki67和hpv基因的检测性能最佳。

51、进一步地，所述核酸检测试剂盒进行核酸检测时，将碱性磷酸酶浓度控制在2μm，此酶浓度下催化底物显色效果达到最佳。